《Gene Therapy》：CRISPR-AuNP: physicochemical optimization of a gold nanoparticle platform for cost-effective and modular non-viral gene editing in HSPCs
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本研究針對造血干細胞/祖細胞（HSPC）基因編輯中病毒載體和電穿孔技術的局限性，開發了一種模塊化、低成本的金-聚合物雜化納米顆粒（CRISPR-AuNP）平臺。通過優化Cas9與金表面的相互作用機制，研究人員實現了Cas9、Cas12a及Cas12a-M29-1核糖核蛋白（RNP）的高效遞送，在原發性CD34+HSPC中達到>10%的編輯效率且不影響細胞活性。該平臺可在2小時內組裝完成，成本低于70美元/百萬細胞，為CRISPR技術在HSPC研究與治療中的普及提供了新策略。
基因編輯技術CRISPR-Cas9自2012年問世以來，徹底改變了生命科學領域的研究范式，尤其在治療遺傳性疾病方面展現出巨大潛力。2023年，基于CRISPR-Cas9編輯的自體造血干細胞/祖細胞（HSPC）療法Casgevy?相繼在美國和英國獲批用于鐮狀細胞病治療，標志著基因編輯臨床應用的里程碑。然而，當前HSPC的離體基因編輯仍依賴電穿孔技術，這一過程存在細胞毒性高、需專用設備、成本昂貴等局限，嚴重制約了其全球可及性。此外，病毒載體遞送CRISPR組件可能因長期表達增加基因毒性風險，而脂質納米顆粒（LNP）等非病毒遞送系統在HSPC中易受細胞翻譯活性低的限制。因此，開發安全、高效、低成本的非病毒遞送平臺成為領域內亟待突破的關鍵問題。
為解決上述挑戰，Jennifer E. Adair團隊在《Gene Therapy》發表研究，報道了一種模塊化金納米顆粒平臺CRISPR-AuNP的優化策略。研究通過系統性優化Cas9 RNP與金納米顆粒的物理化學相互作用，顯著提升了基因編輯效率。關鍵技術方法包括：采用Turkevich法合成金納米顆粒核心；通過動態光散射（DLS）和冷凍透射電鏡（cryo-TEM）表征顆粒理化性質；使用硫醇化聚乙烯亞胺-聚乙二醇（PEI-PEG-SH）共聚物包裹RNP以增強內體逃逸；以原發性人CD34+HSPC（來自健康供體動員后采集）為模型，通過流式細胞術檢測β2-微球蛋白（B2M）蛋白敲低，并通過DNA測序量化插入/缺失（indel）頻率。
β2-微球蛋白作為模型靶點評估CRISPR-AuNP遞效
研究以人B2M基因作為編輯靶點，其編碼的細胞表面蛋白可通過流式細胞術快速檢測編輯后蛋白表達缺失。通過gRNA篩選及電穿孔驗證，最終選定靶向B2M外顯子2的Cas9 gRNA 4用于后續納米顆粒優化，該位點編輯后可導致54.7%的B2M蛋白表達喪失。
第一代CRISPR-AuNP中Cas9負載不足
初代CRISPR-AuNP采用硫醇化crRNA-trRNA雙鏈錨定金納米顆粒的策略，但SDS-PAGE分析顯示Cas9核酸酶負載量幾乎檢測不到。進一步研究發現，低pH加載條件導致crRNA-trRNA雙鏈解離，造成trRNA缺失（僅9.2條/顆粒），且共聚焦顯微鏡顯示顆粒多滯留于細胞表面，無法有效內化。
第二代平臺通過預組裝RNP增強穩定性但內體逃逸不足
改進后的二代策略先將Cas9與gRNA預組裝成RNP復合體，再在pH 3.8條件下連接至金納米顆粒，使每顆粒負載量提升至39個Cas9 RNP。然而，盡管體外切割實驗證實RNP活性保留，但共聚焦成像顯示顆粒被困于內體中，且PEI-PEG共聚物涂層不足（N/P=0.5）導致編輯效率僅呈非顯著趨勢。
第三代CRISPR-AuNP通過聚合物優化實現高效編輯
研究進一步提出“先形成RNP-聚合物復合體，后連接金納米顆粒”的三代策略。通過篩選不同PEG-SH嫁接率（2%-20%）的PEI共聚物，發現20%嫁接率（P20PSH）在N/P=2時可平衡編輯效率與細胞毒性。優化后顆粒直徑約49 nm，負載35個RNP/顆粒，編輯效率提升至13.23%，且Cas12a與Cas12a-M29-1系統也分別實現15.07%和13.39%的編輯效率。
研究結論指出，第三代CRISPR-AuNP平臺通過模塊化設計解決了RNP負載穩定性與內體逃逸效率的瓶頸，在原發性HSPC中達到治療相關編輯水平（>10% indel），且成本低于70美元/百萬細胞。該技術無需特殊設備，2小時內即可完成組裝，為資源有限環境下的基因編輯研究提供了可及性方案。未來通過靶向配體修飾或聚合物工程進一步優化內體逃逸效率，有望推動其在臨床中的應用。
