《Nature Communications》：CHAMP1 is an essential regulator for human myoblast fusion and muscle development
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本研究揭示了CHAMP1（染色體對(duì)齊維持磷蛋白1）在人類成肌細(xì)胞融合中的關(guān)鍵作用。研究人員通過(guò)CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)CHAMP1缺失會(huì)導(dǎo)致成肌細(xì)胞融合缺陷，機(jī)制上證實(shí)CHAMP1作為MyoD的共激活因子直接調(diào)控關(guān)鍵肌細(xì)胞融合蛋白Myomaker（MYMK）的表達(dá)。利用患者來(lái)源細(xì)胞驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CHAMP1突變引起的融合障礙可通過(guò)恢復(fù)Myomaker表達(dá)完全挽救。該研究不僅闡明了CHAMP1綜合征肌肉病變的細(xì)胞自主性機(jī)制，更為相關(guān)疾病的治療提供了新靶點(diǎn)。
骨骼肌的發(fā)育和再生依賴于成肌細(xì)胞的融合，這一過(guò)程由肌肉特異性融合蛋白Myomaker（MYMK）和Myomixer（MYMX）精密調(diào)控。然而，調(diào)控這些融合蛋白表達(dá)的分子機(jī)制尚不明確。與此同時(shí)，CHAMP1基因突變會(huì)導(dǎo)致CHAMP1綜合征，患者表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、肌張力低下和肌無(wú)力，但CHAMP1在肌肉發(fā)育中的具體功能仍是未解之謎。
為解決這一科學(xué)問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR篩選平臺(tái)發(fā)現(xiàn)CHAMP1是成肌細(xì)胞融合的關(guān)鍵調(diào)控因子。在《Nature Communications》發(fā)表的這項(xiàng)研究中，作者證實(shí)CHAMP1缺失的人成肌細(xì)胞在體外和移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后均出現(xiàn)融合障礙。令人驚訝的是，CHAMP1已知功能與有絲分裂中的染色體對(duì)齊相關(guān)，而成肌細(xì)胞融合發(fā)生在退出細(xì)胞周期的細(xì)胞中，這表明CHAMP1在肌肉發(fā)育中扮演著非經(jīng)典角色。
研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，CHAMP1缺失細(xì)胞中MYMK表達(dá)顯著下調(diào)。更為關(guān)鍵的是，在CHAMP1缺陷細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)Myomaker可完全挽救融合缺陷，而表達(dá)Myomixer或MyoD則無(wú)此效果，說(shuō)明MYMK下調(diào)是融合障礙的核心原因。
為了揭示機(jī)制，研究者通過(guò)染色質(zhì)結(jié)合和蛋白質(zhì)互作實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CHAMP1作為MyoD的共因子直接激活MYMK表達(dá)。CUT&Tag分析顯示，CHAMP1與MyoD在MYMK基因內(nèi)含子區(qū)的增強(qiáng)子區(qū)域共結(jié)合，且兩者的結(jié)合相互依賴。結(jié)構(gòu)功能分析進(jìn)一步鑒定出CHAMP1蛋白上的C2H2型鋅指基序（特別是第4個(gè)鋅指）是介導(dǎo)與MyoD互作和激活MYMK表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域。
關(guān)鍵技術(shù)方法
研究采用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建CHAMP1和MyoD敲除的人成肌細(xì)胞系；通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析差異表達(dá)基因；利用CUT&Tag技術(shù)繪制CHAMP1和MyoD的基因組結(jié)合譜；采用患者來(lái)源皮膚成纖維細(xì)胞（來(lái)自Coriell研究所，GM27353和GM27963）進(jìn)行MyoD誘導(dǎo)的肌源性轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)；通過(guò)免疫共沉淀和鄰近連接實(shí)驗(yàn)（PLA）驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用；使用人成肌細(xì)胞移植模型評(píng)估體內(nèi)融合能力。
CHAMP1缺失導(dǎo)致人成肌細(xì)胞融合缺陷
免疫染色顯示CHAMP1蛋白在分化前后的成肌細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)表達(dá)。CRISPR介導(dǎo)的CHAMP1敲除并不影響細(xì)胞增殖和存活，但完全抑制了多核肌管的形成。將人CHAMP1敲除細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，形成的肌纖維橫截面積顯著小于野生型細(xì)胞，證實(shí)CHAMP1是成肌細(xì)胞融合的必需因子。
CHAMP1通過(guò)激活Myomaker表達(dá)調(diào)控融合
轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，CHAMP1敲除細(xì)胞中MYMK是下調(diào)最顯著的基因之一（下調(diào)7.1倍）。免疫印跡和免疫染色證實(shí)MYMK蛋白水平降低。功能挽救實(shí)驗(yàn)表明，在CHAMP1缺陷細(xì)胞中重新表達(dá)Myomaker可完全恢復(fù)融合能力，而表達(dá)Myomixer或MyoD則無(wú)此效果，證明CHAMP1特異性通過(guò)調(diào)控MYMK表達(dá)控制融合。
患者來(lái)源細(xì)胞驗(yàn)證病理機(jī)制
來(lái)自CHAMP1綜合征患者的皮膚成纖維細(xì)胞在MyoD誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為肌樣細(xì)胞后，表現(xiàn)出明顯的融合障礙和MYMK表達(dá)下調(diào)。重要的是，通過(guò)病毒載體補(bǔ)償Myomaker表達(dá)可完全挽救患者的細(xì)胞融合缺陷，表明CHAMP1相關(guān)肌肉病變具有細(xì)胞自主性，且Myomaker補(bǔ)償是潛在治療策略。
CHAMP1與MyoD互作調(diào)控MYMK轉(zhuǎn)錄
CUT&Tag數(shù)據(jù)顯示CHAMP1與MyoD在基因組上高度共定位（72.6%的CHAMP1結(jié)合位點(diǎn)與MyoD重疊），兩者共同結(jié)合于MYMK基因的增強(qiáng)子區(qū)域。蛋白質(zhì)互作實(shí)驗(yàn)證實(shí)CHAMP1與MyoD直接相互作用。值得注意的是，CHAMP1缺失不影響MyoD的核定位，反之亦然，表明兩者的互作是功能特異性的。
C2H2鋅指基序的關(guān)鍵作用
通過(guò)系列截短突變體實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)CHAMP1的C2H2型鋅指基序是其功能的核心區(qū)域。單獨(dú)表達(dá)包含5個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)域（占全長(zhǎng)蛋白45%）即可完全恢復(fù)CHAMP1敲除細(xì)胞的融合能力。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)第4個(gè)鋅指基序（H756/760A）是介導(dǎo)與MyoD互作的關(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變完全消除了CHAMP1的功能。
本研究系統(tǒng)闡明了CHAMP1在人類肌肉發(fā)育中的非經(jīng)典功能：作為MyoD的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過(guò)其C2H2鋅指基序與MyoD互作，直接激活MYMK表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)成肌細(xì)胞融合。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了CHAMP1綜合征肌肉病變的細(xì)胞自主性機(jī)制，將染色體對(duì)齊蛋白與肌源性轉(zhuǎn)錄調(diào)控聯(lián)系起來(lái)，更提出了通過(guò)補(bǔ)償Myomaker表達(dá)治療CHAMP1相關(guān)肌肉缺陷的新策略。研究還提示CHAMP1可能在神經(jīng)發(fā)育等CHAMP1綜合征的其他癥狀中發(fā)揮類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，為全面理解這一罕見(jiàn)疾病提供了新視角。
