肌肉是人體運(yùn)動系統(tǒng)的核心組成部分，其正常發(fā)育對維持生命活動至關(guān)重要。然而，肌肉缺陷常見于人類發(fā)育性疾病，常導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙。這些缺陷源于復(fù)雜的組織相互作用和罕見的基因突變，凸顯了系統(tǒng)性鑒定調(diào)控人類肌肉生成（myogenesis）細(xì)胞自主性機(jī)制的必要性。盡管利用模式生物的研究揭示了骨骼肌生成的基本機(jī)制，但物種間遺傳相互作用的差異可能導(dǎo)致對相同基因突變產(chǎn)生不同的表型反應(yīng)。特別是大多數(shù)模式生物遺傳多樣性有限，可能在遺傳異質(zhì)性更強(qiáng)的人類群體中才會顯現(xiàn)的基因功能被掩蓋。這些局限性凸顯了直接在人類系統(tǒng)中研究基因功能，以更好理解人類疾病分子基礎(chǔ)的重要性。

近期，永生化人類成肌細(xì)胞已成為研究人類肌肉發(fā)育和疾病分子機(jī)制的有力系統(tǒng)。然而，用于解析這一過程中復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可擴(kuò)展遺傳工具仍然有限。為填補(bǔ)這一空白，研究團(tuán)隊在《Nature Communications》上發(fā)表了最新研究成果，開發(fā)了一種創(chuàng)新的CRISPR篩選平臺，為人類肌肉研究領(lǐng)域帶來了突破性進(jìn)展。

研究人員主要運(yùn)用了幾項關(guān)鍵技術(shù)：首先建立了來自7名供者多個解剖部位的人類永生化成肌細(xì)胞模型；其次開發(fā)了靶向6896個基因的肌肉特異性CRISPR敲除文庫（MyoCRISPR-KOLib）；最關(guān)鍵的是設(shè)計了基于分裂毒素（split-toxin）的表型讀出策略，通過白喉毒素A片段（DTA）的蛋白質(zhì)反式剪接（intein-mediated protein trans-splicing）實(shí)現(xiàn)融合缺陷細(xì)胞的特異性富集；此外還應(yīng)用了單細(xì)胞CRISPR與RNA測序聯(lián)用技術(shù)（single-cell CRISPR&RNA-seq）和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等生物信息學(xué)方法。

研究人員首先評估了來自7名供者的人類成肌細(xì)胞系的肌肉生成潛力。這些細(xì)胞先前按照既定流程生成，從不同解剖部位、年齡和性別的骨骼肌活檢組織中分離NCAM1⁺肌肉前體細(xì)胞，經(jīng)過永生化處理并基于高肌肉生成潛力進(jìn)行克隆篩選。分化指數(shù)范圍為94.6%至98.7%，融合指數(shù)從90.7%至98.0%。時間進(jìn)程RNA測序分析顯示所有供者來源的成肌細(xì)胞中肌肉分化標(biāo)志物（包括MYH1、MYH2、MYH3等）和肌肉融合因子（MYMK、MYMX）的表達(dá)迅速誘導(dǎo)。基因集富集分析（GSEA）顯示，培養(yǎng)的人類成肌細(xì)胞的分子特征與體內(nèi)人類胎兒肌肉分化程序高度相似。核型分析證實(shí)這些永生化人類成肌細(xì)胞即使在較高傳代次數(shù)（20代）仍保持正常的二倍體基因組，為基因功能研究提供了理想的遺傳模型。

研究團(tuán)隊設(shè)計了一種更具成本效益且肌肉靶向的基因敲除gRNA文庫，稱為MyoCRISPR-KOLib。這個慢病毒CRISPR文庫靶向6896個基因，這些基因在多個供者的人類成肌細(xì)胞中，在肌肉誘導(dǎo)前后均持續(xù)表達(dá)高于相對較低的閾值（TPM>1）。雖然該文庫靶向的蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量僅為全基因組文庫的三分之一左右，但所選基因 collectively 產(chǎn)生約90%在人類成肌細(xì)胞分化各階段表達(dá)的所有人類蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。通過簡單的成肌細(xì)胞適應(yīng)性篩選，研究人員驗證了MyoCRISPR-KOLib在靶向內(nèi)源基因方面的功效，成功識別出419個對人類成肌細(xì)胞存活或增殖必需的基因和47個負(fù)向細(xì)胞周期調(diào)控因子。

研究成功的關(guān)鍵在于能夠富集表現(xiàn)出特定且可區(qū)分生物表型的突變體。成肌細(xì)胞融合代表骨骼肌發(fā)育和再生的關(guān)鍵步驟，是研究人類肌肉發(fā)生的相關(guān)且可量化的細(xì)胞表型。為實(shí)現(xiàn)融合缺陷突變體的選擇性富集，研究人員將細(xì)胞融合與細(xì)胞存活選擇耦合，開發(fā)了分裂毒素策略。該策略基于分裂白喉毒素A片段（DTA）與內(nèi)含肽（intein）的結(jié)合，當(dāng)兩個分別表達(dá)互補(bǔ)毒素片段（DTAN-InteinN和InteinC-DTAc）的成肌細(xì)胞群體共培養(yǎng)時，細(xì)胞間融合允許通過內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接在合胞體內(nèi)重建活性毒素，從而選擇性殺死多核肌管。

利用該平臺，研究人員進(jìn)行了初步遺傳篩選，系統(tǒng)性地識別人類成肌細(xì)胞融合的上游調(diào)控因子。該篩選發(fā)現(xiàn)了250個命中基因（FDR<0.1；p值<0.0035），其中14個是已知的肌肉生成基因，包括肌肉融合因子Myomaker（MYMK）、肌肉調(diào)控因子Myf5和MyoD，以及MyoD相關(guān)誘導(dǎo)因子（CUL3、p38）和輔因子（TCF12、p300）。研究人員通過兩種互補(bǔ)方法驗證了篩選結(jié)果：生成靶向前250個命中基因的聚焦CRISPR文庫，在另外兩種人類成肌細(xì)胞系和小鼠原代成肌細(xì)胞中重復(fù)基于分裂毒素的融合篩選；對125個隨機(jī)選擇的命中基因進(jìn)行單獨(dú)驗證，證明這些基因的破壞導(dǎo)致未融合細(xì)胞比例顯著增加。

通過STRING分析構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，揭示了篩選命中基因間的1286個PPI，這些相互作用涉及160個融合篩選命中基因，聚類成23個蛋白質(zhì)復(fù)合物。與人類醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫的交叉引用分析顯示，41個融合篩選命中基因的突變導(dǎo)致以異常骨骼肌形態(tài)為特征的人類疾病。這些基因在圖中用α標(biāo)記。對融合篩選命中基因與小鼠表型組數(shù)據(jù)的平行交叉引用分析確定了48個基因，其突變導(dǎo)致異常產(chǎn)前生長/體重/體型，這些基因在圖中用β標(biāo)記。

研究人員應(yīng)用基于分裂條形碼的單細(xì)胞RNA測序技術(shù)（scRNA-seq）來無偏倚地調(diào)查在我們?nèi)诤虾Y選中存活的每個融合缺陷成肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化。采用表達(dá)常規(guī)gRNA和聚腺苷酸化gRNA的慢病毒CROP-seq構(gòu)建體，允許同時進(jìn)行CRISPR基因編輯和通過scRNA-seq檢測gRNA。細(xì)胞聚類和表達(dá)分析確定了10個不同的簇，通過差異表達(dá)基因分析，確定了253個成肌細(xì)胞標(biāo)志物和142個肌細(xì)胞標(biāo)志物，這些基因用于計算單個細(xì)胞的基于表達(dá)的"肌肉分化評分（MDS）"。分析顯示，用靶向MyoD-TCF12-p300輔因子復(fù)合物的gRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞分化評分最低，而帶有Myomaker（MYMK）gRNA的細(xì)胞評分最高。用靶向其他蛋白質(zhì)復(fù)合物的gRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞也顯示出比表達(dá)MYMK gRNA的細(xì)胞降低的分化評分，表明在肌肉分化中存在更廣泛的缺陷。

這項工作開發(fā)并驗證了一種遺傳篩選平臺，通過高覆蓋度篩選識別了大量先前未被認(rèn)識的調(diào)控人類成肌細(xì)胞融合激活的必需因子。這些基因的CRISPR擾動在不同人類供者的各種肌肉組織來源細(xì)胞以及小鼠原代成肌細(xì)胞中均顯示出成肌細(xì)胞融合表型。單細(xì)胞CRISPR和轉(zhuǎn)錄組分析能夠通過利用大量基因標(biāo)志物靈敏測量肌肉分化，提供比依賴少數(shù)肌肉生成標(biāo)志物的常規(guī)方法更準(zhǔn)確的評估。這些實(shí)驗結(jié)果表明，許多成肌細(xì)胞融合篩選命中基因通過控制成肌細(xì)胞融合上游的更廣泛肌肉生成程序來調(diào)控成肌細(xì)胞融合。

該研究建立的篩選平臺不僅為定量和系統(tǒng)解析人類肌管形成上游調(diào)控因子提供了有力工具，還報告了一組有前景的候選基因，這些基因?qū)θ祟惣∪馍�成和先天性肌肉疾病至關(guān)重要。擴(kuò)展這種方法的應(yīng)用將促進(jìn)對以分化和融合受損為特征的肌肉疾病的遺傳剖析。盡管取得了豐富的新發(fā)現(xiàn)，但研究也存在一些局限性，如由于人類成肌細(xì)胞固有的高融合指數(shù)（>90%），篩選可能更適合識別成肌細(xì)胞融合的負(fù)調(diào)控因子，且成肌細(xì)胞融合僅代表肌肉生成的一個狹窄時間窗口，無法揭示人類肌肉生成更早關(guān)鍵階段的機(jī)制。