《Current Opinion in Electrochemistry》：CRISPR-Integrated Electrochemical Biosensors for Precision Molecular Diagnostics
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本文綜述了CRISPR-Cas系統(tǒng)與電化學傳感器結(jié)合在生物分子檢測中的應用，分析了信號放大、靈敏度提升及微流控整合對傳統(tǒng)電化學傳感器核酸檢測的改進，探討了人工智能在數(shù)據(jù)解析和診斷優(yōu)化中的作用，并總結(jié)了商業(yè)化面臨的挑戰(zhàn)與未來發(fā)展方向。
Lorelai Schoch | Ryan Preska | Deependra K. Ban | Kiana Aran
徐堅-Gen Lay 生物工程系，雅各布斯工程學院
摘要
電化學生物傳感器由于其快速性、經(jīng)濟性和便攜性，在診斷領(lǐng)域，尤其是在即時血糖監(jiān)測方面，取得了顯著進展。盡管取得了這些成就，但將其應用擴展到檢測DNA、RNA和microRNA仍然具有挑戰(zhàn)性，主要原因是對核苷酸修飾的敏感性和特異性不足。在這方面，CRISPR-Cas系統(tǒng)通過提供精確且可編程的核酸（即DNA/RNA）識別能力，徹底改變了分子診斷技術(shù)。在這篇綜述中，我們詳細探討了將CRISPR-Cas系統(tǒng)與電化學生物傳感器結(jié)合如何提升生物分子檢測能力。首先，我們概述了電化學傳感的基本組成部分，然后討論了在復雜生物環(huán)境中檢測生物分子所面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。隨后，我們描述了CRISPR-Cas系統(tǒng)的核心組成部分和分子機制，并探討了這些機制如何被應用于電化學平臺中以檢測特定疾病的核酸（DNA和RNA），以及它們在蛋白質(zhì)檢測中的新興潛力。接下來，我們介紹了通過信號放大、提高敏感性和微流控集成等方法來增強基于CRISPR的電化學傳感的技術(shù)。此外，我們還討論了人工智能在改進數(shù)據(jù)解釋和提升基于CRISPR的電化學傳感器診斷性能方面的作用。最后，我們討論了實施基于CRISPR的電化學傳感器診斷所面臨的更廣泛挑戰(zhàn)，并總結(jié)了利用CRISPR-Cas技術(shù)開發(fā)經(jīng)濟、可擴展且精確的電化學診斷平臺的未來前景。
引言
分子診斷技術(shù)，特別是特定疾病核酸生物標志物的檢測，已經(jīng)徹底改變了臨床和公共衛(wèi)生決策。從在大流行期間檢測病毒基因組到識別遺傳突變和監(jiān)測癌癥復發(fā)，核酸診斷技術(shù)提供了無與倫比的特異性和敏感性[1]、[2]。雖然傳統(tǒng)技術(shù)（如實時聚合酶鏈反應（PCR）和下一代測序）非常準確，但它們需要復雜的儀器、熟練的操作人員以及耗時的工作流程[3]。這導致了在新突變檢測方面的差距，尤其是在資源有限或時間敏感的即時護理（POC）應用中。
此外，COVID-19大流行凸顯了開發(fā)快速、可靠且易于調(diào)整以應對變異株的分散式診斷工具的緊迫性。在這方面，電化學生物傳感器因其低成本、便攜性、快速響應時間以及微型化和數(shù)字集成的潛力而成為一種變革性的診斷工具[4]、[5]。這些傳感器將化學和生物分子相互作用轉(zhuǎn)化為電信號，從而實現(xiàn)定量和定性分析。然而，當應用于核酸診斷時，傳統(tǒng)的電化學傳感器在敏感性、特異性和穩(wěn)健性方面存在局限性，尤其是在復雜的臨床樣本中[6]。這主要是由于它們依賴于核酸鏈的雜交，而目標分子的二級結(jié)構(gòu)或堿基錯配可能會阻礙這一過程[7]、[8]。在這方面，發(fā)現(xiàn)的一種名為CRISPR（規(guī)律間隔短回文重復序列）的細菌防御系統(tǒng)及其相關(guān)的Cas蛋白為克服這些挑戰(zhàn)開辟了新途徑[9]、[10]。
將CRISPR-Cas與電化學傳感器結(jié)合可以創(chuàng)建一個協(xié)同平臺，將CRISPR的生物識別和放大能力與電化學的實時、可擴展讀數(shù)相結(jié)合（見表1）。這篇綜述介紹了新興的CRISPR集成電化學生物傳感器的現(xiàn)狀，強調(diào)了可能推動該領(lǐng)域朝著快速、便攜和高度敏感的生物分子診斷方向發(fā)展的進展。我們還探討了如何將人工智能引入這些平臺以實現(xiàn)數(shù)據(jù)解釋、多重檢測和檢測優(yōu)化。我們進一步討論了為廣泛部署基于CRISPR的電化學傳感器必須解決的技術(shù)和轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)。
1.電化學傳感器設計與進展
一個標準的電化學生物傳感器由三個電極組成：工作電極（WE）、參比電極（RE）和對電極（CE）（圖1.A）。‘WE’被生物識別分子（如DNA/RNA探針、抗體、適配體或CRISPR-Cas復合物）修飾，以與特定分析物相互作用。‘RE’通常由Ag/AgCl或飽和甘汞電極組成，保持穩(wěn)定的參考電位，而CE（通常是鉑或碳）完成電路（圖1.A）[19]、[20]。‘WE’上的生物分子相互作用通過循環(huán)伏安法（CV）、安培法和電化學阻抗譜（EIS）等技術(shù)轉(zhuǎn)化為可測量的電信號[21]、[22]、[23]。
此外，電化學生物傳感器的性能受到發(fā)生生化識別的界面的關(guān)鍵影響。為了減少非特異性結(jié)合或污染，可以使用納米結(jié)構(gòu)材料，如金納米顆粒[24]、石墨烯[16]、[25]、[26]和碳納米管[27]、[28]。這些材料增加了探針固定的表面積，促進了電子轉(zhuǎn)移，提高了信噪比[18]。使用抗污染復合材料（如牛血清白蛋白（BSA）或兩性聚合物）進行表面修飾，可以在復雜樣本（如血液或唾液）中保持檢測的完整性[12]、[28]。此外，微制造和絲網(wǎng)印刷電極的進步使得電化學傳感器能夠微型化和多重化[29]，允許同時檢測不同的目標，從而提高診斷通量和可靠性[18]。例如，最近使用噴墨打印的納米結(jié)構(gòu)金電極與無電池NFC電位計結(jié)合，能夠高靈敏度和快速周轉(zhuǎn)率同時檢測SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因，突顯了基于CRISPR的多重檢測技術(shù)在便攜格式中的潛力[30]。
部分摘錄
分類、關(guān)鍵組件和酶促機制
CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物中的一種適應性免疫機制，旨在防御噬菌體感染。它由兩個主要組件組成：Cas蛋白（作為可編程核酸酶）和工程化的引導RNA（gRNA），后者指導這些核酸酶與目標序列匹配。CRISPR系統(tǒng)分為兩類：第一類使用多蛋白效應器復合物，第二類使用單一的大效應器蛋白[31]。
信號放大和靈敏度提升策略
盡管CRISPR-Cas12和Cas13酶通過其伴隨切割活性具有內(nèi)在的信號放大特性，即一個目標分子可以誘導許多報告分子的切割[37]、[41]。通過整合聚合酶鏈反應（PCR，如等溫核酸擴增）和納米材料沉積（例如Au–Fe3O4納米顆粒），可以進一步增強這種放大效果。在一項研究中，實施這些放大方法提高了RNA的檢測效果
商業(yè)努力和挑戰(zhàn)
盡管在學術(shù)上取得了顯著進展，但基于CRISPR-Cas的生物電子傳感器的商業(yè)化仍然有限。唯一的顯著商業(yè)進展集中在石墨烯場效應晶體管（gFET）平臺上，該平臺由Cardea Bio首創(chuàng)，后來被Paragraf收購，該公司開發(fā)了基于CRISPR和石墨烯的生物傳感器和阻抗分析技術(shù)，隨后CRISPR-QC獲得了評估CRISPR配方用于基因編輯應用的許可[16]。除此之外，
結(jié)論與展望
CRISPR集成電化學生物傳感器結(jié)合了酶的精確性和電信號的簡單性，為診斷技術(shù)帶來了變革潛力。CRISPR電化學系統(tǒng)因其多重檢測能力和易于重新配置的特點而具有價值。未來的研究應集中在上游樣本處理技術(shù)、AI引導的檢測開發(fā)、多重CRISPR陣列、酶優(yōu)化和法規(guī)協(xié)調(diào)上。隨著持續(xù)的創(chuàng)新，這些生物傳感器將進一步發(fā)展
貢獻
這篇綜述的想法由KA和DKB提出。LS在DKB和KA的指導下撰寫了手稿。DKB、LS和RP收集了參考文獻。LS協(xié)助獲得了圖表的使用權(quán)并提供了最終編輯。所有作者都對最終手稿提供了評論和反饋。
利益聲明
作者聲明以下財務利益/個人關(guān)系可能被視為潛在的競爭利益：
Kiana Aran報告稱獲得了美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的財務支持。如果有其他作者，他們聲明沒有已知的競爭財務利益或個人關(guān)系可能影響本文所述的工作。
致謝
我們感謝NIH RO1 HL139605、NSF EAGER 316843-00001（加州大學圣地亞哥分校）、NSF EFMA 2526846以及加州大學圣地亞哥分校的Aims Project 2045293對本綜述的財務支持。
