《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Identification and overexpression of genes encoding sugar alcohol transporter and metabolic enzymes for accelerated utilization in the yeast
Kluyveromyces marxianus
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通過CRISPR-Cas9和NHEJ方法敲除釀酒酵母Kluyveromyces marxianus的候選轉運酶基因，發現KmSAT1編碼山梨醇轉運蛋白，KmXYL2和KmSOU2分別負責山梨醇和甘露醇的代謝。過表達這些基因顯著提升對糖醇的利用效率，縮短生長滯后期，光密度高于葡萄糖培養基。
江部智史（Satoshi Ebe）、中村仁美（Hitomi Nakamura）、松田光成（Mitsunari Matsuda）、寺內由紀（Yuki Terauchi）、赤田麟司（Rinji Akada）、星田久（Hisashi Hoshida）
山口大學科學技術創新研究生院應用化學系，日本宇部市常磐臺2-16-1，郵編755-8611
酵母Kluyveromyces marxianus能夠吸收多種糖類，包括山梨醇和甘露醇。然而，包括糖轉運蛋白在內的糖類利用代謝途徑仍有待闡明。為了識別這些基因，我們首先使用一種新開發的非同源末端連接（NHEJ）介導的基因破壞方法，結合CRISPR-Cas9系統進行靶向切割，共篩選出13個候選轉運蛋白基因。雖然大多數突變體在各種糖培養基中表現出生長缺陷不明顯，但KmMLEV2025基因（命名為KmSAT1）的突變體在山梨醇或甘露醇培養基中均無法生長，這表明該基因編碼一種糖醇轉運蛋白。接下來，我們研究了對糖醇代謝至關重要的脫氫酶基因，因為糖醇需要通過脫氫酶轉化為果糖。已知KmXyl2p是一種木糖醇脫氫酶，因此它也是山梨醇脫氫酶的候選基因。KmXYL2的突變導致菌株在山梨醇培養基中生長受阻，而在甘露醇培養基中則無此現象。通過進一步破壞多個基因，我們發現了甘露醇脫氫酶：KmSOU2（被注釋為山梨糖還原酶）的突變導致菌株在甘露醇培養基中生長受阻。這些基因的過表達有助于更有效地利用糖醇。過表達KmSAT1但不表達脫氫酶基因的菌株能夠立即開始生長，而野生型菌株則需要幾天時間才能生長。此外，山梨醇和甘露醇培養基中的最終細胞光密度均高于葡萄糖培養基。這些結果表明，過表達糖醇轉運蛋白是生物技術應用中的有效策略。
部分內容摘要
酵母菌株與培養基
本研究中使用的K. marxianus菌株列于表S1中。酵母培養使用了YPD培養基（1%酵母提取物、2%多肽和2%葡萄糖）、YPGal培養基（YPD培養基中的葡萄糖被2%半乳糖替代）以及SD培養基（2%葡萄糖、0.17%酵母氮源（不含氨基酸和硫酸銨）、0.5%硫酸銨以及額外的營養素，包括亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸、腺嘌呤半硫酸鹽和尿嘧啶）。利用CRISPR-Cas9和NHEJ介導的標記基因插入進行基因破壞
當含有KmADE2基因的質粒pUDP082被引入K. marxianus菌株后，部分轉化菌落呈現紅色，表明KmADE2基因發生了突變（數據未顯示）。如果切割位點發生突變，后續的CRISPR-Cas9介導的切割和DNA插入將無法進行。為避免在引入CRISPR-Cas9質粒的過程中發生突變，我們將表達Cas9的啟動子進行了修改。利用CRISPR-Cas9和NHEJ進行基因破壞
在本研究中，我們確定了K. marxianus吸收山梨醇和甘露醇所需的轉運蛋白和脫氫酶。我們采用了一種新開發的基因破壞方法來識別這些基因。該方法通過CRISPR-Cas9系統進行切割，將沒有同源序列的標記基因整合到目標基因中。CRediT作者貢獻聲明
江部智史：撰寫、審稿與編輯、數據可視化、實驗驗證、數據分析。中村仁美：實驗研究。松田光成：實驗研究。寺內由紀：撰寫、審稿與編輯。赤田麟司：撰寫、審稿與編輯。星田久：撰寫、原始草稿撰寫、項目管理、資金申請、概念構思。致謝
我們感謝Jean-Marc Daran博士提供質粒pUDP082，幫助我們開發了本研究中的新型CRISPR-Cas9系統。本研究得到了JST SPRING（資助編號JPMJSP2111）、NAGASE科學技術基金會和大阪發酵研究所（資助編號LA-2023-018）的支持。同時，我們也感謝山口大學基因研究中心提供的分析儀器。作者聲明不存在利益沖突。
