《Nucleic Acids Research》：RNA G-quadruplexes promote codon repeat-associated ribosomal frameshifting in human genes
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本研究揭示了RNA G-四鏈體(rG4)作為關鍵順式作用元件，在人類基因中廣泛促進密碼子重復相關核糖體移碼(CRFS)的新機制。研究人員通過全基因組CRISPR篩選發現RNA結合蛋白RBM4能特異性結合HDAC1 mRNA中的rG4結構并增強其+1移碼效率。實驗證實rG4結構的穩定性和空間構象直接調控移碼效率，且該機制在多種基因背景下具有普適性。該發現為理解真核生物翻譯重編程提供了新視角，對揭示非經典蛋白質多樣性產生機制具有重要意義。
在基因表達調控的復雜網絡中，核糖體移碼（ribosomal frameshifting）作為一種特殊的翻譯重編程機制，長期以來被認為主要存在于病毒和原核生物中。然而近年來研究發現，這種機制在人類等真核生物中同樣廣泛存在，尤其是我們團隊前期發現的密碼子重復相關核糖體移碼（codon repeat-associated ribosomal frameshifting, CRFS）現象，能夠在多種人類組織中產生具有生物學功能的移碼蛋白。但大多數短密碼子重復序列自身并不能誘導高效的移碼效率，暗示著其他順式和反式作用元件的參與。
為了揭示CRFS的調控機制，發表在《Nucleic Acids Research》上的這項研究開展了系統性探索。研究人員首先構建了組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1, HDAC1）基因的CRFS報告系統，通過全基因組CRISPR篩選成功鑒定出RNA結合蛋白RBM4作為HDAC1移碼的關鍵增強因子。進一步機制研究表明，RBM4通過特異性識別HDAC1 mRNA編碼區中形成的RNA G-四鏈體（RNA G-quadruplex, rG4）結構來促進核糖體移碼。
研究的關鍵發現是，位于HDAC1基因（UAC）3密碼子重復下游的rG4結構是移碼發生的核心元件。通過圓二色譜（circular dichroism, CD）分析證實該序列確實能夠形成典型的平行G-四鏈體結構，且其穩定性受鉀離子和rG4特異性配體的調控。點突變實驗顯示，破壞rG4關鍵鳥嘌呤位點會顯著降低移碼效率，而應用rG4穩定劑PhenDC3則能增強移碼。
尤為重要的是，這種rG4介導的移碼促進效應具有普適性。將HDAC1來源的rG4序列插入其他基因（如LRRC17、SETD2等）的密碼子重復下游，均能顯著提升其移碼效率。同時，來自不同基因背景的rG4結構（如NRAS、Trf2和TERRA）也展現出類似的移碼促進功能。全基因組分析進一步發現，rG4 motifs在密碼子重復下游區域顯著富集，質譜分析數據中鑒定出48個潛在的rG4介導CRFS事件，其中3個代表性位點（FOXO3、HAX1和CRACR2B）的實驗驗證均支持rG4在移碼中的關鍵作用。
技術方法方面，研究主要采用雙熒光素酶報告系統定量評估移碼效率，結合全基因組CRISPR篩選鑒定調控因子；運用RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）驗證RBM4與靶RNA的相互作用；通過體外轉錄翻譯系統（兔網織紅細胞裂解物和粗糙脈孢菌裂解物）驗證rG4的功能獨立性；利用圓二色譜分析rG4結構特征；并整合核糖體圖譜（ribosome profiling）數據和質譜分析（mass spectrometry）進行基因組水平驗證。
主要研究結果
RBM4通過結合rG4促進HDAC1移碼
研究人員首先構建了基于HDAC1 CRFS序列的雙熒光報告系統，通過全基因組CRISPR篩選發現RBM4是HDAC1移碼的關鍵正調控因子。RNA免疫共沉淀實驗證實RBM4能特異性結合HDAC1 mRNA中的rG4區域。核糖體圖譜分析顯示，rG4結構上游存在明顯的核糖體滯留現象，提示rG4可能通過引起核糖體停滯而促進移碼。
rG4是HDAC1移碼的關鍵順式元件
通過定點突變HDAC1中的rG4形成序列，發現破壞G-tracts會顯著降低移碼效率。體外翻譯實驗進一步驗證了這一結果。使用rG4穩定劑PhenDC3處理可增強移碼，而 destabilizer TMPyP4則抑制移碼，證明rG4結構的穩定性直接調控移碼效率。
rG4介導的移碼促進具有普適性
將HDAC1來源的rG4序列插入LRRC17、SETD2等基因的密碼子重復下游，能顯著提升這些基因的移碼效率。不同來源的rG4結構（NRAS、Trf2、TERRA）在多種基因背景下均展現出移碼促進功能，表明rG4作為移碼促進元件的普遍性。
基因組水平驗證rG4與CRFS的關聯
生物信息學分析顯示，rG4 motifs在密碼子重復下游區域顯著富集。基于人類蛋白質組數據的篩選鑒定出34個基因中的48個潛在rG4介導CRFS位點，其中FOXO3、HAX1和CRACR2B三個位點的實驗驗證證實了rG4在移碼中的關鍵作用。
研究結論與意義
本研究系統闡明了編碼區rG4結構作為一種新型翻譯重編程元件的分子機制。發現RBM4-rG4調控軸在CRFS中的核心作用，不僅拓展了對真核生物基因表達調控機制的認識，也為理解非經典蛋白質產生的多樣性提供了新視角。rG4介導的移碼促進效應在多種基因背景下的普適性，提示這可能是真核生物中一種較為保守的基因表達調控策略。該研究為后續探索rG4在生理病理條件下的功能，以及開發基于rG4的基因表達調控工具奠定了重要基礎。
