《Nature Communications》：Coiled-coil heterodimer-mediated split base editing systems enable flexible and robust nucleotide substitutions
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為解決傳統堿基編輯器尺寸過大而難以被AAV病毒有效包裝遞送的難題，研究人員開發了一種基于卷曲螺旋異源二聚體介導的拆分堿基編輯系統（CC-BE）。該研究通過將脫氨酶與nCas9分別融合到能夠特異性二聚化的卷曲螺旋肽對（如P3/P4或N5/N6）上，成功構建了CC-CBE、CC-ABE等多種編輯器。研究結果表明，CC-BE系統在多種細胞類型和基因位點上均能維持甚至提升堿基編輯效率，并在小鼠模型中通過雙AAV遞送成功實現了對Pcsk9和Dmd基因的高效體內編輯，為基因治療提供了更靈活、高效的平臺。
在精準基因編輯領域，CRISPR堿基編輯器能夠在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下實現單堿基的精準替換，為治療由點突變引起的遺傳病帶來了巨大希望。然而，基于SpCas9的堿基編輯器尺寸過大，超出了常用遞送載體——腺相關病毒（AAV）約4.7 kb的包裝容量限制，這嚴重阻礙了其在體內的治療應用。雖然科學家們已經開發了諸如內含肽介導的拆分編輯器或微型堿基編輯器等策略來應對這一挑戰，但這些方法或存在設計復雜、可能因留下“足跡”而影響蛋白功能的問題，或面臨編輯效率低、靶向范圍有限等局限。因此，開發一種既靈活又高效的堿基編輯系統，以滿足體內治療的需求，成為了該領域亟待解決的關鍵問題。
針對這一瓶頸，發表在《Nature Communications》上的研究論文提出了一種創新的解決方案：卷曲螺旋異源二聚體介導的拆分堿基編輯系統（CC-BE）。研究人員巧妙地利用了卷曲螺旋肽段（如P3/P4或N5/N6對）能夠通過疏水和靜電作用形成特異性強、結合緊密的二聚體這一特性，將完整的堿基編輯器“拆分”成兩個部分：一部分是脫氨酶（如胞嘧啶脫氨酶APOBEC3或腺嘌呤脫氨酶TadA8e）與一個卷曲螺旋肽（如P3或N5）的融合蛋白，另一部分是nCas9（Cas9切口酶）與另一個互補卷曲螺旋肽（如P4或N6）的融合蛋白。當這兩個部分被共同遞送到細胞中后，卷曲螺旋肽會像“分子磁鐵”一樣將脫氨酶和nCas9拉近，在靶DNA位點重新組裝成有功能的堿基編輯器。
為開展此項研究，研究人員首先利用AlphaFold 3進行了蛋白質三維結構預測，證實了CC-BE系統的可行性。他們構建了多種CC-BE版本，包括CC-CBE（如CC-BE3）、CC-ABE（如CC-ABE8e）以及它們的衍生工具（如CC-TadCBE、CC-ABE9和CC-AYBE）。研究的關鍵技術方法包括：利用質粒轉染（如PEI、電穿孔）將編輯器組分導入多種細胞系（如HEK293T、小鼠胚胎成纖維細胞MEF、豬胎兒成纖維細胞PFF）進行體外效率驗證；通過雙AAV載體（血清型8和9）包裝CC-BE組件，并通過腹腔或肌肉注射等方式遞送至小鼠體內進行體內編輯評估；采用熒光激活細胞分選（FACS）富集轉染細胞，并通過高通量測序（如下一代測序）精確分析靶位點的堿基編輯效率、旁觀者編輯及indel頻率；利用全基因組測序（WGS）全面評估系統的脫靶效應；并通過免疫熒光染色、RT-PCR、Western Blot以及血清生化指標檢測等手段，在杜氏肌營養不良癥（DMD）的△Ex51小鼠模型和野生型小鼠模型中驗證了CC-BE的治療效果。
CC-CBE具有高編輯活性和擴展的靶向范圍
研究人員首先開發了基于卷曲螺旋的拆分胞嘧啶堿基編輯器（CC-CBE）。結果表明，在HEK293T細胞中多個內源位點，sCBE-P3P4和sCBE-N5N6的C-to-T編輯效率顯著高于未拆分的BE3和直接拆分的對照組（sCBE-ctrl），平均提升分別達到2.8倍和2.9倍，并且在某些位點（如RNF2 site 2）提升高達9.6倍。同時，CC-CBE的編輯窗口（position 3-13）相較于傳統BE（position 4-8）更寬。研究還通過對比不同核定位信號（NLS）數量的編輯器以及Western Blot分析，排除了NLS數量或Cas9蛋白表達水平差異是效率提升的主要原因，推測卷曲螺旋肽引起的構象變化可能是關鍵。
CC-ABE系統展現高效編輯效率
類似地，研究人員構建了CC-ABE系統（如CC-ABE8e）。在13個人類基因組位點的測試中，CC-ABE（sABE-P3P4和sABE-N5N6）展現了與未拆分ABE8e相當甚至更高的A-to-G編輯效率，并且其編輯窗口（A9-A14）的活性更高。研究還開發了基于拆分Cas9的迭代版本CC-ABE，以潛在地降低Cas9依賴性脫靶活性，結果顯示其編輯效率與未拆分系統相似且未增加indel。
工程化CC-BE變體：TadCBE, ABE9和AYBE
為了驗證CC策略的普適性，研究人員將其應用于其他堿基編輯器變體。開發的CC-TadCBE在C-to-T編輯效率上顯著高于未拆分的TadCBE和直接拆分的對照組。CC-ABE9實現了精確的A-to-G編輯，而CC-AYBE則成功實現了A-to-Y（A-to-C/A-to-T）的顛換編輯，且脫靶indel產物水平可控。
擴展CC-BE系統的靶向范圍
通過使用識別更寬松PAM（NG）的SpCas9-NG變體，研究人員構建了NG-CC-BE（NG-CC-BE3和NG-CC-ABE8e）。測試結果表明，NG-CC-BE在含有NG PAM的位點保持了高效編輯，進一步拓寬了CC-BE系統的應用范圍。
CC-BE在原代豬胎兒成纖維細胞中的穩健編輯
在PFF細胞中，CC-CBE的編輯效率相較于未拆分CBE系統有顯著提升（如在IGF1位點提升12.4倍），且編輯窗口更寬。CC-ABE也展現了與未拆分ABE相當的編輯效率，而直接拆分的ABE系統效率則低得多。
CC-BE的脫靶效應評估
通過針對特定sgRNA的預測脫靶位點分析、正交R-loop實驗評估sgRNA非依賴性脫靶以及全基因組測序（WGS）分析，研究人員對CC-BE的脫靶效應進行了全面評估。結果表明，CC-BE產生的單核苷酸變異（SNV）和小插入/缺失（indel）與未拆分BE以及無sgRNA的對照組相比，沒有顯著增加，全基因組范圍內的SNV分布也無明顯區域偏好性，證明CC-BE具有較高的編輯保真度。
CC-ABE介導Fah點突變校正
在Fah突變小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）模型中，利用CC-ABE靶向Fah基因外顯子8末端的致病性G-to-A點突變，成功實現了A-to-G校正，恢復了正確的閱讀框，證明了其治療遺傳性酪氨酸血癥I型（HTI）的潛力。
通過雙AAV實現體內高效靶向編輯Pcsk9基因
研究人員使用雙AAV8載體遞送CC-ABE（sABE-P3P4）至小鼠體內，靶向編輯肝臟中的Pcsk9基因。結果顯示，通過腹腔或靜脈注射，均能實現高效的A-to-G編輯（在高劑量下可達~70%），并成功降低了血清中的PCSK9水平、總膽固醇和低密度脂蛋白（LDL）膽固醇水平，且未引起急性肝功能障礙，證實了CC-BE在體內降脂治療中的有效性。
通過雙AAV9遞送NG-CC-ABE在AEx51小鼠中恢復抗肌萎縮蛋白表達
為治療杜氏肌營養不良癥（DMD），研究人員使用雙AAV9載體遞送靶向Dmd基因外顯子50剪接供體位點的NG-CC-ABE至△Ex51 DMD模型小鼠。通過腹腔或局部肌肉注射，在多種肌肉組織（如心肌、腓腸肌、脛骨前肌等）中均檢測到有效的A-to-G編輯，誘導了外顯子50跳躍，從而恢復了抗肌萎縮蛋白轉錄本的閱讀框。免疫染色證實了抗肌萎縮蛋白表達的恢復，血清中的肌酸激酶（CK）和α-羥丁酸脫氫酶（α-HBDH）等肌肉損傷標志物水平也接近野生型小鼠，表明治療有效緩解了疾病表型。
綜上所述，這項研究成功開發了一種基于卷曲螺旋異源二聚體的通用型拆分堿基編輯平臺（CC-BE）。該平臺巧妙地解決了大尺寸堿基編輯器難以用單AAV遞送的難題，不僅保持了與未拆分編輯器相當甚至更高的編輯效率，還展現出更寬的編輯窗口和良好的靶向特異性。研究人員在多種細胞類型、Cas9變體（SpCas9, SpCas9-NG）以及不同的堿基編輯器（CBE, ABE, TadCBE, ABE9, AYBE）上驗證了該策略的有效性，并通過對Pcsk9和Dmd基因的成功體內編輯，證明了其在治療代謝性疾病和單基因遺傳病方面的巨大應用潛力。與已有的拆分技術（如內含肽系統）或微型編輯器相比，CC-BE系統在設計上更為簡單靈活，無需在功能蛋白上尋找特定的切割位點，避免了可能影響蛋白功能的“足跡”殘留，為未來體內基因治療提供了強有力的新工具。
