《Biosensors and Bioelectronics》：Bulge DNA-driven CRISPR/Cas12a dynamic activation circuit enables highly sensitive and versatile biosensing
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CRISPR/Cas12a動態激活電路CBD實現核酸和非核酸高靈敏度檢測，通過bulge DNA結構觸發自擴增信號，構建“OR”邏輯門支持多重毒素同步監測。
魏魯宇|程子琦|徐明瑞|陳恒業|蘭偉|龍萬軍|佘遠斌|傅海燕
中國中南民族大學藥學院少數民族醫學現代化工程技術研究中心，武漢430074
摘要
CRISPR/Cas12a 已成為一種創新的生物傳感工具；然而，其切割信號的線性積累限制了檢測靈敏度。本文報道了一種由凸起DNA（BD）驅動的CRISPR/Cas12a動態激活電路（稱為CBD），該電路是一種高度靈敏且多用途的生物傳感平臺，可用于檢測核酸和非核酸目標。BD結構經過合理設計，在凸起部分降解時能夠進行可編程的結構和功能轉換，從而觸發Cas12a電路的指數級自我放大激活。對于核酸目標，Cas12a的直接識別會引發BD的切割并形成正反饋循環，使得對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢測靈敏度達到14 CFU/mL。對于非核酸目標，將一種通用的單鏈DNA激活劑連接到適配體互補鏈上，實現目標響應性的釋放并隨后啟動CBD系統，而無需改變crRNA或BD序列。這種策略使得農藥和霉菌毒素的檢測濃度可達到皮克克每毫升（picogram-per-milliliter）的水平。此外，還構建了一個“OR”邏輯門，用于同時檢測多種霉菌毒素，突顯了該平臺在多重危險監測方面的能力。總體而言，CBD作為下一代生物傳感技術的新范式展現了巨大潛力。
引言
致病危害有多種形式，如病原菌、農藥殘留物和霉菌毒素，其中許多即使在微量水平下也具有高度毒性（Lei等人，2025年；Wang等人，2024年）。傳統的分析技術，如定量聚合酶鏈反應（qPCR）（Vogels等人，2020年）和高性能液相色譜（HPLC）（Gu等人，2025年），仍然是檢測臨床病原體、環境污染物和食品毒素的金標準。然而，這些方法通常需要復雜的儀器、繁瑣的樣品制備過程以及受過培訓的人員。近年來，成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）及其相關蛋白12a（Cas12a）由于其可編程的識別和切割活性而成為一種強大的分子診斷工具（Hao等人，2023年；Tong等人，2024年）。然而，一個主要限制是信號輸出受到目標分子與激活的Cas12a之間一對一化學計量關系的約束（Saha等人，2024年），再加上較慢的催化轉化速率（kcat ≈ 1 s-1）（Lim等人，2025年）。因此，信號放大是線性累積的，限制了基于CRISPR/Cas12a的生物傳感器的靈敏度，僅能達到皮摩爾級別（Huyke等人，2022年）。為了克服這一限制，人們將各種目標預放大技術整合到CRISPR/Cas12a中，例如HOLMES（Li等人，2018年）和DETECTR（Chen等人，2018年）等平臺。盡管這些混合檢測方法實現了阿托摩爾級別的靈敏度，但性能提升主要來自于預放大步驟本身，從而削弱了CRISPR/Cas12a作為主要檢測機制的作用。因此，迫切需要開發無需預放大的CRISPR/Cas12a生物傳感系統，以保持高靈敏度并簡化實際應用的工作流程。
為了在不依賴核酸預放大的情況下提高靈敏度，基于CRISPR/Cas12a的生物傳感策略大致可以分為三類：（1）協同信號放大。這些策略將CRISPR/Cas12a與下游放大模塊結合使用，例如酶催化（例如辣根過氧化物酶）（Samanta等人，2022年；Wei等人，2024年）或核酸后放大技術（例如滾環放大）（Feng等人，2022年；Li等人，2021年）。雖然這些組合可以顯著增強信號輸出，但它們通常需要額外的生化成分，可能會干擾Cas12a系統的活性或穩定性。（2）催化轉化效率提升。這種方法通過蛋白質工程（Cao等人，2025年；Wu等人，2024年）或crRNA的化學修飾（Barber等人，2024年；Li等人，2017年）來提高Cas12a的固有切割效率。盡管這些修飾具有潛力，但它們通常需要大量的人工和時間，且可能影響系統的簡單性和可編程性。（3）通過目標富集或信號循環增加激活的Cas12a數量。微反應平臺，包括微流控技術（Chen等人，2023年）和微滴系統（Du等人，2023年；Zhao等人，2024年），已被用于濃縮激活的Cas12a復合物并通過空間限制加速反應動力學（Li等人，2023年）。另一種方法是開發核酸電路設計，通過循環驅動的信號循環來增加激活的Cas12a數量（Deng等人，2024年），提供了一種概念上簡單但高效的無需預放大的信號放大策略。
迄今為止，僅報道了少數利用核酸電路的基于CRISPR/Cas12a的生物傳感系統。例如，Shi等人提出了一種名為CONAN的CRISPR/Cas12a驅動的催化電路，用于高靈敏度檢測基因組DNA（Shi等人，2021年）。在該系統中，一種可切換的籠狀引導RNA（scgRNA）作為Cas12a的切割底物。在目標識別后，scgRNA從非活性crRNA轉變為活性形式，進而激活另一個Cas12a，啟動自我傳播的信號放大級聯反應。盡管CONAN實現了阿托摩爾級別的靈敏度，但由于需要合成含有雙熒光團和淬滅劑的scgRNA，因此成本較高。最近，Lim等人引入了一種包含阻塞核酸引發的內部正反饋循環的CRISPR/Cas12a級聯電路，實現了快速且無需預放大的檢測（Lim等人，2025年）。在該設計中，Cas12a切割阻塞的核酸中間體后釋放單鏈DNA（ssDNA），進而激活新的Cas12a/crRNA復合物進行信號循環。然而，與雙鏈DNA（dsDNA）相比，使用ssDNA作為Cas12a激活劑的效率相對較低（Chen等人，2018年）。這些限制凸顯了迫切需要一種成本低廉、快速且高效的可切換分子觸發器，以充分發揮基于核酸電路的CRISPR/Cas12a生物傳感平臺的潛力。
在這項工作中，我們提出了一種由凸起DNA（BD）驅動的CRISPR/Cas12a動態激活電路（稱為CBD），用于無需預放大且多用途的生物傳感（圖1）。BD被合理設計為包含一個原間隔序列（PAM）的dsDNA，并帶有凸起結構。在目標識別后，激活的Cas12a同時切割BD中的發夾結構熒光報告基因和凸起區域，凸起部分的降解產生帶有5’-磷酸（5’-PO42-）和3’-羥基（3’-OH）末端的DNA。3’-OH末端首先經歷3’-5’外切核酸酶處理，然后由Klenow片段進行5’-3’聚合酶延伸，重新生成含有PAM的dsDNA激活劑（圖S1）。這一過程允許Cas12a反復激活并實現指數級信號放大，確保高檢測靈敏度。對于非核酸檢測，由適配體互補的可變區域和Cas12a激活劑標簽組成的ssDNA探針與適配體結合，形成功能性核酸（FN），并固定在鏈霉親和素修飾的磁性納米顆粒（MNPs）上。當非核酸目標結合時，適配體發生構象變化，釋放ssDNA探針，激活CBD系統生成放大信號。值得注意的是，可切換的BD設計無需任何修飾，可實現指數級信號放大，并且易于擴展到多種分析物，使CBD成為一種簡單、高靈敏度且廣泛適用的下一代CRISPR/Cas12a檢測平臺。
部分摘錄
使用CBD熒光法檢測核酸
對于模態dsDNA的檢測，將LbCas12a（200 nM）與通用crRNA在NEBuffer 2.1中于37 °C孵育15分鐘來組裝Cas12a/crRNA核糖核蛋白（RNP）復合物。對于MRSA的檢測，將LbCas12a（200 nM）與MRSA-crRNA（250 nM）和通用crRNA在NEBuffer 2.1中于37 °C孵育15分鐘來組裝Cas12a/crRNA核糖核蛋白（RNP）復合物。復合物形成后，加入4.3 μL的10× NEBuffer 2.1、3.7 μL的熒光報告基因（5 μM）和5 μL的模態dsDNA
BD作為可切換的激活中間體
最初，直接比較了ssDNA和dsDNA激活劑的Cas12激活效率，這兩種激活劑都被設計為與相同的通用crRNA完全互補。如圖S3所示，dsDNA激活劑誘導的Cas12a激活效率高于等摩爾的ssDNA激活劑，為dsDNA激活劑介導正反饋循環提供了直接的實驗支持。因此，BD被合理設計為一段26個堿基對的凸起dsDNA
結論
總結來說，我們開發了一種由凸起DNA（BD）驅動的CRISPR/Cas12a動態激活電路（稱為CBD），實現了真正的指數級信號放大、高靈敏度和多用途檢測。CBD系統能夠直接檢測低至14 CFU/mL的MRSA，并通過MNP輔助的信號轉換策略間接檢測非核酸目標（乙酰甲胺磷和OTA），靈敏度達到皮克克每毫升（pg/mL）級別。此外，還構建了一個基于雙目標“OR”邏輯門的CBD系統
CRediT作者貢獻聲明
陳恒業：可視化。蘭偉：寫作——審稿與編輯。魏魯宇：寫作——初稿撰寫、可視化、研究、概念化。程子琦：可視化、方法學、研究。徐明瑞：方法學。佘遠斌：寫作——審稿與編輯、資金獲取。傅海燕：寫作——審稿與編輯、監督、資金獲取。龍萬軍：寫作——審稿與編輯
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文的研究工作。
利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文的研究工作。
致謝
本工作得到了國家重點研發計劃（2023YFF1104002）、中南民族大學的學術創新團隊基金（XTZ24029）、湖北省自然科學基金（2025AFB247）以及中央高校的基礎研究基金（CZQ25029）的財政支持。
