《Bone》：Clec4a2 deficiency promotes post-fission osteoclast cell death and suppresses acute inflammation-induced bone loss in the mouse
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Clec4a2/Clec4d在骨吸收調節中的雙重作用及其治療潛力研究。通過CRISPR-Cas9技術構建敲除小鼠模型，發現Clec4a2敲除促進骨吸收細胞分化但抑制骨吸收效率，因細胞分裂后死亡；而Clec4d敲除僅輕微影響骨形態。該研究首次證實Clec4a2作為炎癥性骨破壞治療靶點，揭示了骨吸收細胞存活的關鍵機制。
藤田宏文|太勇馬|高橋健二|上田雄人|北川和奈|小野光明|大橋敏隆|大內英男
日本岡山大學醫學部、牙科學院及藥學部細胞學與組織學系
摘要
為了實現破骨細胞（一種特化的先天免疫細胞）高效地吸收骨骼，不僅要促進破骨細胞的分化和激活，還要維持其存活。C型凝集素（CLEC）受體能夠識別病原體配體以及發生改變的自身組織，其中包含激活型和抑制型受體，這種平衡既能清除病原體，又能防止過度的免疫反應。然而，CLEC受體在破骨細胞分化、功能及存活中的作用仍不明確。我們建立了高表達破骨細胞CLEC受體的敲除（KO）小鼠，并分析了破骨細胞的特征和骨骼形態。我們利用小鼠基因表達數據集對破骨細胞譜系特異性CLEC受體進行了全面的計算機模擬篩選，并通過多靶點CRISPR-Cas9系統生成了Clec4a2和Clec4d的單基因及雙基因敲除（DKO）小鼠。Clec4a2 KO和DKO小鼠在體外增強了破骨細胞的分化，Clec4a2 KO還促進了破骨細胞的增大。Clec4d KO略微減少了股骨的 trabecular 骨密度，而在生理條件下Clec4a2 KO和DKO小鼠的骨骼形態未受影響。與傳統觀點（即破骨細胞分化增強會導致骨骼吸收增加）相反，我們的時間序列分析顯示Clec4a2 KO小鼠雖然增加了破骨細胞的數量，但由于分裂后破骨細胞及其子細胞的死亡，反而降低了吸收效率。Clec4a2 KO小鼠對脂多糖誘導的炎癥性骨丟失具有保護作用，這表明Clec4a2可能成為治療炎癥性骨溶解性疾病的新靶點。本研究提出了一種新的機制：CLEc4a2對破骨細胞存活的調節對于高效吸收骨骼至關重要。
引言
骨骼組織通過成骨細胞（形成骨骼）和破骨細胞（吸收骨骼）之間的動態平衡不斷重塑，健康人體內大約10%的成熟骨骼組織每年都會更新[1]，[2]。成骨細胞和骨細胞產生對破骨細胞存活和分化至關重要的調節分子，尤其是巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體激活劑配體（RANKL，屬于TNF超家族）[3]。這些細胞因子刺激單核-巨噬細胞譜系細胞，使其分化為成熟的破骨細胞。此外，Fc受體共同γ亞基和DNAX激活蛋白12均含有免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAMs），它們介導RANK-RANKL信號通路中的共刺激信號[4]，[5]。急性及慢性炎癥狀態（如骨折和類風濕性關節炎）會引發炎癥性骨丟失[4]�；罨蟮钠乒羌毎ㄟ^RANKL（由促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6刺激）表達而過度吸收骨骼。因此，免疫系統的多個組分都參與了骨骼代謝和骨骼疾病的發生。
C型凝集素（CLEC）受體是一類重要的碳水化合物結合蛋白，在病原體識別和免疫調節中發揮關鍵作用[6]，[7]，[8]。這些受體具有一種或多種C型凝集素樣結構域，能夠識別碳水化合物及其他配體，包括病原體相關分子模式（PAMPs）、損傷相關分子模式（DAMPs）以及自身組織中的改變標記物。CLEC受體主要表達于髓系細胞群體中，如樹突狀細胞和巨噬細胞。從功能上看，CLEC受體分為激活型和抑制型：激活型CLEC受體利用ITAMs觸發促炎反應，而抑制型CLEC受體則通過免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIMs）抑制免疫活性[6]。
過去十年的研究顯示，多種CLEC受體參與了骨骼代謝和骨骼疾病[9]。含有ITAM的CLEC受體Clec5a（也稱為MDL-1）在自身免疫性關節炎癥、登革病毒感染和腸道炎癥過程中是破骨細胞生成和骨侵蝕的關鍵調節因子[10]，[11]，[12]。Clec4d（也稱為MCL）和含有ITIM的CLEC受體Clec4a2（也稱為DCIR）可促進破骨細胞生成，但不影響成骨細胞分化[13]。另一項研究則指出Clec4a2在膠原誘導的關節炎中調節破骨細胞生成和關節破壞[14]。含有ITIM的CLEC受體Ly49Q可正向調節破骨細胞分化[15]，但不會影響骨骼形態。盡管已有研究表明含有ITAM和ITIM基序的CLEC受體參與骨骼代謝和炎癥性骨破壞，但它們在免疫調節機制中的實際功能仍需進一步驗證。
基于這些發現，我們重點研究了在破骨細胞譜系中高表達的CLEC受體，旨在通過單基因和多基因敲除方法闡明這些受體在骨骼代謝中的功能關系及其在破骨細胞分化和吸收能力中的作用。在本研究中，我們通過計算機模擬分析了破骨細胞譜系中高表達的CLEC受體，并通過生成敲除小鼠來研究它們的作用。
動物實驗
所有動物實驗程序均獲得了岡山大學機構動物護理和使用委員會的批準（批準編號：OKU-2021774、OKU-2021775、OKU-2022922、OKU-2022923、OKU-2022977、OKU-2022981、OKU-2022984和OKU-2024441）。實驗用小鼠（C57BL/6N，RRID:MGI:2159965）購自日本SLC公司（靜岡）。小鼠被飼養在每個籠子最多五只的條件下，處于無特定病原體（SPF）環境中，光照/黑暗周期為12小時，溫度為23°C。
利用多靶點CRISPR-Cas9系統生成Clec4a2 KO、Clec4d KO和Clec4a2/4d DKO小鼠
首先，我們利用包含骨髓巨噬細胞、破骨細胞以及89種其他細胞類型和組織的小鼠基因表達數據集，對破骨細胞譜系特異性受體進行了全面的計算機模擬分析。我們鑒定出幾種CLEC受體——特別是Clec4a2、Clec4d和Clec5a——這些基因在破骨細胞中具有譜系特異性和高表達模式（補充圖S1A）。這些基因在C57BL/6小鼠的骨髓巨噬細胞（BMMs）及由BMMs衍生的破骨細胞中的表達情況如下：
討論
為了實現破骨細胞高效吸收骨骼，不僅要促進破骨細胞的分化和激活，還要維持其存活。根據含有ITIM基序的Clec4a2的結構特征，人們原本認為它會抑制破骨細胞的吸收功能。然而，本研究意外地發現，Clec4a2基因的缺失反而促進了破骨細胞及其分裂后子細胞的死亡。
CRediT作者貢獻聲明
藤田宏文：撰寫初稿、驗證、監督、軟件使用、項目管理、方法設計、實驗設計、資金申請。
太勇馬：實驗研究。
高橋健二：實驗研究。
上田雄人：實驗研究。
北川和奈：實驗研究。
小野光明：實驗研究。
大橋敏隆：撰寫、審稿與編輯。
大內英男：撰寫、審稿與編輯、監督、項目管理、資金申請。
利益沖突聲明
無。
致謝
本研究得到了日本學術振興會（JSPS）KAKENHI項目（編號：19K09625、20K21655、22K09305）以及岡山縣科學技術振興廳的資助。同時感謝T. Bando和K. Sato的討論與合作。
