《Journal of Hazardous Materials》：Novel genomically engineered antibiotic-free whole-cell biocatalysts for PET hydrolysis and waste remediation
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PET降解的基因組整合穩定生物催化劑系統開發：通過CRISPR相關轉座酶系統在E. coli染色體上整合PETase基因，利用優化Braun脂蛋白信號肽系統實現酶穩定表面展示，無需抗生素或誘導劑，經多代傳代后仍保持高降解活性，并通過HPLC驗證副產物生成，為規模化塑料污染生物降解提供可持續解決方案。
Katherine Romero-Orejon | Hamid Reza Karbalaei-Heidari | Nediljko Budisa | David Levin
曼尼托巴大學生物系統工程系，加拿大溫尼伯
摘要
塑料污染是一個日益嚴重的環境問題，需要穩定且可持續的生物技術解決方案。本文報道了一種通過將PETase基因整合到大腸桿菌中，實現微生物降解PET的重大進展。該方法利用穩定的、無需誘導劑和抗生素的全生物催化劑。通過CRISPR相關轉座酶系統，PETase基因被插入到特定的染色體位點，并在組成型啟動子控制下表達，從而無需質粒或選擇標記。在此基因組框架下，Braun脂蛋白信號肽（Lpp-SP）系統被優化，以高效地將PETase錨定并暴露在細菌表面，從而創建出強健的全細胞生物催化劑。通過生化測定、Western blotting和流式細胞術驗證了PETase的表面定位和活性，結果表明其功能在多代培養后仍然保持穩定。經過17代培養后，EC-PET1中的酶活性仍保留了90%以上；經過10代培養后，EC-FP1中的酶活性約為70%。使用高效液相色譜（HPLC）鑒定出降解產物，包括單(2-羥乙基)對苯二甲酸（MHET）和對苯二甲酸（TPA）。優化后的大腸桿菌 EC-FP1菌株在OD600 = 1.0/mL的條件下，3天內從半結晶PET顆粒中產生了0.18 mM的MHET。這些結果證明了基因工程微生物作為大規模處理塑料廢棄物的強大且可持續工具的可行性，同時避免了基于質粒系統的遺傳不穩定性和代謝負擔。
引言
塑料污染是現代最緊迫的環境挑戰之一。每年產生的塑料廢棄物超過4億噸，但僅有不到10%得到有效回收，大部分塑料垃圾長期滯留在垃圾填埋場和自然生態系統中[1]、[2]。聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）因其耐用性和多功能性成為瓶子和紡織品的主要成分，占全球聚合物產量的約18%[3]。這種穩定性反而增加了其降解的難度，推動了可持續回收策略的探索。
大規模有效的酶促降解需要上游的機械處理（如粉碎成碎片或粉末），以增加生物催化劑可接觸的表面積。在本研究中，我們使用市售的PET粉末作為標準化的高表面積模型底物，在受控條件下評估了我們工程化生物催化劑的核心性能，這些條件符合該領域的現有方法。
生物方法作為物理和化學回收的低能耗替代方案顯示出巨大潛力[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。一個關鍵突破是發現了Ideonella sakaiensis 201-F6菌株，它利用兩種酶系統降解PET：PETase將聚合物分解為可溶性中間體單(2-羥乙基)對苯二甲酸（MHET），隨后MHETase將其進一步水解為單體對苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）[9]、[10]、[11]。利用這些酶，合成生物學實現了全細胞生物催化劑的發展，主要通過在大腸桿菌[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]和酵母[19]、[20]、[21]等宿主細胞表面展示PETase來實現。例如，經過優化的大腸桿菌菌株在受控條件下對PET粉末的降解率超過了70%[22]、[23]、[24]。
然而，一個關鍵的可擴展性障礙仍然存在。現有系統主要依賴于基于質粒的表達方式，這需要持續補充抗生素和誘導劑，導致代謝負擔增加、遺傳不穩定以及高昂的運營成本，使得工業應用不切實際[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。在大規模生物過程中，失去質粒的細胞會抑制工程菌株的生長，導致工藝失敗。為克服這些限制，我們開發了一種染色體整合策略，創建了穩定且無需抗生素的全細胞生物催化劑。我們使用CRISPR相關轉座酶（CAST）系統VcTn6677，將基因構建精確地整合到
大腸桿菌的特定基因組位點，確保了無選擇壓力的穩定長期基因表達[31]、[32]、[33]、[34]。
我們的設計利用了
大腸桿菌天然的脂蛋白（Lpp）轉運途徑來實現酶的穩定展示。我們構建了包含組成型啟動子（cLppP）、Lpp信號肽（Lpp-SP）和PETase編碼序列的表達盒。如圖1所示，Lpp-SP將融合蛋白導向SecYEG轉運系統。經過二酰基甘油轉移酶（Lgt）、信號肽酶II（LspA）和脫脂蛋白N-酰基轉移酶（Lnt）的連續修飾后，成熟的蛋白質通過三酰基半胱氨酸（3AcCys）錨定在細胞表面。ABC轉運蛋白LolCDE及其伴侶蛋白LolA和受體LolB將脂化蛋白轉運到外膜（OM）進行整合[36]、[37]、[38]。
在我們的構建中，Lpp的C末端結構被PETase取代。通過基因組整合和表達，這種設計利用天然Lpp途徑將PETase穩定地錨定在細胞表面，無需質粒、誘導劑或抗生素。
在本研究中，我們報道了基因工程改造的、無需抗生素的大腸桿菌生物催化劑用于PET水解的開發與表征。通過CAST將PETase表達盒直接整合到染色體中，我們創建了能夠持續產生并表面展示活性酶的穩定菌株。這些全細胞催化劑在實驗室條件下展示了降解PET顆粒和薄膜的能力。這一基于基因組的平臺為下一代塑料廢棄物生物催化提供了可擴展、穩定且可持續的基礎。
材料
粒徑小于300 μm的PET粉末購自Goodfellow Co（產品代碼ES30-PD-000132）。BHET、MHET和TPA由Sigma-Aldrich提供，用作標準參考化合物。
生成Lpp缺失的大腸桿菌菌株（BL21-ΔLpp菌株）
采用CRISPR-Cas9輔助的基因組編輯技術，從內源性Lpp基因的末端刪除了25 bp的編碼序列，并引入了一個TAA終止密碼子，從而在大腸桿菌 BL21（DE3）細胞的基因組中生成了截短的Lpp基因序列，具體方法參考先前發表的文獻[33]。
建立和驗證表面展示平臺：宿主菌株選擇及基于質粒的3AcCys-PETase的活性
為了確定大腸桿菌中的天然Lpp是否干擾3AcCys-PETase的表達和正確定位，我們使用CRISPR-Cas9輔助的基因組編輯技術生成了大腸桿菌 BL21-ΔLpp菌株，該菌株是大腸桿菌 BL21(DE3)的Lpp基因敲除株[33]。通過針對大腸桿菌 BL21-ΔLpp基因組側翼區域的引物擴增Lpp基因，確認了基因片段的成功刪除。
討論
我們采用合成生物學方法開發了一種全細胞生物催化劑，該催化劑通過N末端半胱氨酸三酰基錨（3AcCys）將PETase和FAST-PETase同時固定并暴露在溶劑中。因此，我們建立了一個穩定且無需抗生素的全細胞平臺，可在適中的、生物兼容的溫度下進行PET降解。這種方法與傳統的策略互補，但在概念上有顯著區別。
結論與展望
全球塑料污染危機需要可擴展且可持續的生物解決方案。雖然基于質粒的酶促PET降解系統顯示出潛力，但它們對化學誘導劑、抗生素和不穩定遺傳電路的依賴限制了其實際的大規模應用。
在這項工作中，我們通過使用CRISPR相關轉座酶（CAST）將PETase表達盒永久整合到大腸桿菌基因組中，開發出了下一代全細胞生物催化劑平臺。
環境影響
聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）造成的塑料污染仍然是一個主要的環境問題，而酶促回收受到高成本、穩定性有限以及依賴抗生素或化學誘導劑的限制。在本研究中，我們通過基因工程改造大腸桿菌，使其能夠直接從基因組中穩定產生并展示PET降解酶，從而消除了對外部選擇標記或誘導劑及酶純化步驟的需求。
CRediT作者貢獻聲明
K.L.R.O.負責概念構思、開發、實驗設計、數據管理和初稿撰寫。H.R.K.H.負責概念構思、開發、實驗設計、數據管理和初稿撰寫。N.B.參與概念監督、研究指導以及手稿的撰寫和編輯。
CRediT作者貢獻聲明
David Bernard Levin：撰寫、審稿與編輯、監督、資源協調、項目管理、方法學研究、資金獲取、概念構思。
Hamid Reza Karbalaei-Heidari：撰寫、審稿與編輯、方法學研究、概念構思。
Nediljko Budisa：撰寫、審稿與編輯、監督、資源協調、概念構思。
Katherine Romero-Orejon：初稿撰寫、方法學研究、數據分析、數據管理。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究的資金支持來自加拿大國家研究委員會（NSERC）的Discovery項目（RGPIN-2023-04787），由David Levin博士負責。Nediljko Budisa博士和Hamid Reza Karbalaei-Heidari博士感謝加拿大研究主席計劃（項目編號950-231971）的支持；Katherine Romero-Orejon博士感謝加拿大自然科學與工程研究委員會（NSERC）通過Discovery項目（RGPIN-04945-2017和RGPIN-05669-2020）提供的支持。特別感謝Gerstein博士的協助。
