《Microchemical Journal》：CRISPR for next-generation point-of-care molecular diagnostics
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CRISPR技術為便攜式快速診斷提供高靈敏度解決方案，涵蓋疾病檢測、食品安全、環境監測及可穿戴設備應用，兼具操作簡易性和設備自由特性。
Jinyu Fu|Jiaming Yang|Shuobo Shi|Zhenglin Zhu|Xing Wang|Yaru Li
北京先進軟物質科學與工程創新中心，北京化工大學生命科學技術學院，中國北京100029
摘要
即時檢測（POCT）對于快速疾病診斷至關重要，尤其是在資源有限的環境中。盡管分子診斷方法具有高靈敏度，但現有平臺在便攜性、可擴展性和準確性方面仍存在顯著瓶頸，這限制了其在分布式醫療系統中的應用。本文重點介紹了基于CRISPR的技術作為下一代POCT框架的變革潛力。我們詳細闡述了CRISPR診斷的基本原理，該技術利用可編程的Cas蛋白和引導RNA（gRNAs）來識別特定的核酸。這些系統通常結合等溫預擴增技術（如RPA、LAMP）以提高靈敏度，隨后通過Cas蛋白介導的目標識別和目標激活的信號檢測（如熒光、比色法、側向流動檢測）實現無需設備的可視化結果解讀。此外，我們還探討了基于CRISPR的POCT在臨床診斷、食品安全、環境污染物檢測以及可穿戴設備等領域的廣泛應用。CRISPR診斷方法憑借其操作簡便性、高靈敏度和多樣的信號輸出方式，有望推動即時檢測的快速、準確和普及。
引言
全球醫療保健領域越來越依賴于快速、準確且易于獲取的診斷測試，以指導臨床決策、管理疾病爆發并在資源有限的環境中提供醫療服務。即時檢測（POCT）已成為這一趨勢的基石，它通過將檢測直接從集中式實驗室轉移到患者身邊（無論是在診所、藥店、救護車還是家中）來填補關鍵的診斷空白[1]。全球對POCT的需求反映了其在缺乏適當設備地區的診斷延遲縮短方面的潛力，并涵蓋了臨床診斷、食品安全、環境污染物檢測和可穿戴健康監測等廣泛的應用領域。建立有效的POCT檢測方法需要綜合性的方法，世界衛生組織（WHO）提出了ASSURED標準（經濟實惠、靈敏度高、特異性強、用戶友好、檢測速度快、無需設備且能直接交付給最終用戶）來指導這類檢測方法的開發[2]。
基于核酸（DNA/RNA）的分子診斷方法是識別傳染病、基因變異和癌癥生物標志物的金標準[3]。然而，目前的POCT分子診斷平臺在便攜性、可擴展性和準確性方面存在關鍵技術瓶頸。例如，現有的等溫擴增技術（如RPA、LAMP、RCA）在序列特異性、假陽性率和診斷靈敏度之間存在 trade-offs[4]。直接測序方法雖然分辨率高，但受到昂貴儀器、耗時程序和臨床應用靈敏度不足的限制[5][6]。迫切需要工程化解決方案來克服這些限制，而基于成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）的技術正成為下一代生物傳感和分子診斷的變革性框架。這里的“下一代”指的是基于CRISPR的系統，它們通過實現儀器輕量化、快速檢測和高特異性檢測，克服了傳統方法（如qPCR）在中心實驗室使用的局限性——這是分布式POCT的關鍵。
基于CRISPR的系統能夠在無需目標預擴增的情況下，以飛摩爾級別的靈敏度直接檢測特定的核酸單核苷酸多態性（SNPs），達到并超過臨床診斷的閾值[8]。當與等溫擴增技術（如重組酶聚合酶擴增RPA）結合使用時，這些技術的靈敏度可低至飛摩爾級別[9]。最重要的是，基于CRISPR的檢測方法與肉眼可讀的信號生成平臺（如側向流動檢測[10]和熒光報告分子[11]）的集成，為下一代POCT檢測方法的發展展現了巨大潛力。除了核酸檢測外，CRISPR技術的最新進展還擴展了其應用范圍，包括金屬離子、小分子、代謝物和蛋白質等非核酸目標[12]。這種擴展依賴于將特定非核酸分析物的存在轉化為合成核酸介質，從而激活CRISPR系統產生可檢測的輸出。這大大增強了基于CRISPR的平臺的診斷靈活性。
目前，基于CRISPR的系統在POCT方面表現出獨特的優勢，包括操作簡便性、可擴展的制造性以及高靈敏度和特異性，推動了多種檢測方法的快速發展。基于我們團隊在基于CRISPR的生物傳感器和等溫擴增技術用于快速病原體檢測方面的持續研究[11][13]，本文首先闡明了基于CRISPR的生物傳感的基本原理，詳細介紹了從目標預擴增到CRISPR相關（Cas）蛋白介導的識別以及可視化信號輸出的整個流程。接著，我們比較了關鍵Cas效應因子的操作特性，以評估它們在特定診斷場景中的適用性。此外，本文還概述了快速擴展的應用領域，包括檢測傳染病和癌癥突變、確保食品安全、監測環境污染物以及與可穿戴設備集成以實現持續監測。最后，我們討論了當前面臨的挑戰和未來發展方向，包括新型Cas蛋白的發現與工程化、將CRISPR檢測方法與智能系統和數字健康平臺集成，以及實現轉化所需的監管和倫理考量。
部分摘錄
基于CRISPR的POCT工作流程和操作模塊
基于CRISPR的分子診斷方法利用可編程的Cas蛋白和引導RNA（gRNAs）來特異性檢測目標核酸。根據效應因子模塊的架構，CRISPR-Cas系統主要分為兩類：第一類系統使用多蛋白效應因子復合體（如I型、III型和IV型），而第二類系統使用單一的大效應蛋白（如II型、V型和VI型）[14]。盡管兩類系統都已被用于診斷應用，
CRISPR系統在POCT中的應用
基于CRISPR的POCT技術現在可以實現低至1拷貝/μL的檢測限[7][19]，與實驗室中的qPCR相當，同時保持了即時檢測的兼容性。此外，非核酸目標可以通過適配體、抗體或酶轉化為CRISPR效應因子可識別的核酸信號，而基于CRISPR的信號檢測方法（如旁路切割）可以生成可用于非核酸目標檢測的可測量信號[12]。因此，基于CRISPR的POCT技術已被廣泛應用于結論與展望
基于CRISPR的生物傳感技術已成為分子診斷領域的革命性力量，提供了一個強大且可編程的工具包，有效解決了POCT長期存在的挑戰[7]。通過將Cas效應因子的序列特異性與等溫擴增和用戶友好的可視化讀數（如側向流動檢測、比色法）相結合，這些系統實現了實驗室級別的靈敏度和特異性，而無需依賴復雜的設備
CRediT作者貢獻聲明
Jinyu Fu：撰寫——原始草稿，概念構思。Jiaming Yang：撰寫——原始草稿。Shuobo Shi：撰寫——審稿與編輯，撰寫——原始草稿，概念構思。Zhenglin Zhu：撰寫——審稿與編輯，可視化處理。Xing Wang：撰寫——審稿與編輯，方法學設計。Yaru Li：撰寫——審稿與編輯，撰寫——原始草稿，項目管理，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文研究結果的財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了國防工業技術發展計劃（編號：JCKY2021602B009）的支持。
