《Sensors and Actuators Reports》：Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Current Progress and Future Directions in Rapid Nucleic Acid Detection
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本綜述系統(tǒng)梳理了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)的最新進(jìn)展，涵蓋從引物設(shè)計(jì)、核心酶工程、反應(yīng)體系優(yōu)化到檢測(cè)方法創(chuàng)新的全流程。文章重點(diǎn)探討了LAMP在即時(shí)檢測(cè)（POCT）中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如高靈敏度、強(qiáng)抗干擾性及快速可視化檢測(cè)，并分析了其面臨的假陽(yáng)性、氣溶膠污染等挑戰(zhàn)。通過(guò)整合CRISPR系統(tǒng)、微流控芯片、納米材料等前沿技術(shù)，LAMP正朝著更精準(zhǔn)、高效、便攜的方向發(fā)展，為傳染病防控、食品安全及海關(guān)檢疫等領(lǐng)域提供了強(qiáng)大工具。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）是一種在恒定溫度（通常為60–65°C）下實(shí)現(xiàn)核酸高效擴(kuò)增的技術(shù)。它利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶和一套特異性識(shí)別靶序列多個(gè)區(qū)域（通常為6-8個(gè)）的引物（包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物），無(wú)需熱循環(huán)儀即可在30分鐘內(nèi)將靶核酸擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)至數(shù)十億倍。自2000年Notomi等人發(fā)明以來(lái)，LAMP因其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短以及對(duì)抑制物耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為全球研究最廣泛的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)之一。
LAMP技術(shù)的引物設(shè)計(jì)策略
LAMP的成功高度依賴于精密的引物設(shè)計(jì)。其引物通常針對(duì)靶基因的6個(gè) distinct 區(qū)域，包括F3、F2、F1、B1、B2和B3。為了提升擴(kuò)增速度和靈敏度，還可設(shè)計(jì)環(huán)引物（Loop F和Loop B）。引物設(shè)計(jì)需綜合考慮熔解溫度（Tm值，F(xiàn)1c/B1c和環(huán)引物為64–66°C，F(xiàn)2/B2和F3/B3為59–61°C）、GC含量（40-65%，優(yōu)選50-66%）、引物末端穩(wěn)定性（ΔG ≤ –4 kcal/mol）以及避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。目前常用的引體設(shè)計(jì)工具包括PrimerExplorer V5、LAVA、GLAPD等，它們各有側(cè)重，如GLAPD可利用全基因組序列進(jìn)行群體特異性引物設(shè)計(jì)，而LAMP Designer則整合了BLAST搜索以降低交叉同源風(fēng)險(xiǎn)。
樣本預(yù)處理方法的優(yōu)化
樣本預(yù)處理是保證LAMP檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。直接檢測(cè)法利用LAMP技術(shù)對(duì)復(fù)雜樣本中抑制物的耐受性，簡(jiǎn)化了核酸釋放步驟。常用的預(yù)處理方法包括：
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熱孵育與堿裂解法：簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，但熱穩(wěn)定核酸酶可能影響效率，常與其他方法聯(lián)用。堿裂解（如0.5 M NaOH）效果可與商業(yè)試劑盒媲美，但可能干擾pH依賴性顯色系統(tǒng)。
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蛋白酶K與表面活性劑：蛋白酶K（如Thermolabile Proteinase K）可水解RNase，與表面活性劑（如SDS、Triton X-100、Tween-20）聯(lián)用，能有效裂解細(xì)胞/病毒膜結(jié)構(gòu)并釋放核酸，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
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還原劑與金屬螯合劑：如TCEP可破壞蛋白質(zhì)二硫鍵，EDTA可螯合Mg2+抑制RNase活性。但過(guò)量EDTA可能螯合LAMP反應(yīng)所需的Mg2+，可使用Chelex-100樹(shù)脂替代。聯(lián)用DTT、Chelex-100和熱孵育可顯著降低檢測(cè)限。
核心酶的工程化改造與輔助酶的應(yīng)用
LAMP技術(shù)的核心是DNA聚合酶，其性能直接影響擴(kuò)增效率。
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Bst DNA聚合酶的進(jìn)化：從去除5′→3′外切酶活性的Bst-LF，到通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)同源物、融合核酸結(jié)合域或進(jìn)行電荷工程修飾的突變體（如NEB Bst 2.0/3.0/4.0、Br512、Mut235、SC5678等），Bst DNA聚合酶在熱穩(wěn)定性、擴(kuò)增速度、鹽耐受性、抑制劑抗性、dUTP摻入能力（如Bst 5.0可實(shí)現(xiàn)100% dTTP被dUTP替代）和逆轉(zhuǎn)錄酶活性方面不斷優(yōu)化。
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其他DNA聚合酶：如SD DNA polymerase和OmniAmp polymerase，可在更高溫度下反應(yīng)，抑制引物二聚體形成，提高特異性。
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逆轉(zhuǎn)錄酶：用于RNA檢測(cè)的RT-LAMP。除傳統(tǒng)的AMV、MMLV外，HIV來(lái)源的逆轉(zhuǎn)錄酶及工程化高保真變體（如RTX、SuperScript IV RT）展現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性和過(guò)程性。一些Bst DNA聚合酶突變體（如Bst 3.0）也具備逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
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輔助酶：尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）可降解含dUTP的殘留污染物，防止交叉污染。Tte UvrD解旋酶可抑制非模板擴(kuò)增。RNase抑制劑可保護(hù)RNA模板。DNase I用于去除RNA樣本中的DNA污染。此外，Tth Endonuclease IV、T7E I、RNase HII等也被用于提高檢測(cè)特異性或?qū)崿F(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)換。
LAMP反應(yīng)增強(qiáng)劑的應(yīng)用
反應(yīng)增強(qiáng)劑可從靈敏度、反應(yīng)效率和降低假陽(yáng)性三個(gè)方面提升LAMP性能。
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靈敏度增強(qiáng)：如鹽酸胍可提高靈敏度；鎖核酸（LNA）修飾的分子信標(biāo)可增強(qiáng)熱穩(wěn)定性，降低背景。
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反應(yīng)效率提升：甜菜堿（Betaine）可降低GC豐富模板的Tm值，但濃度需優(yōu)化；牛血清蛋白（BSA）可穩(wěn)定酶活性，但過(guò)量可能因分子擁擠效應(yīng)降低產(chǎn)量；海藻糖（Trehalose）可增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性；L-脯氨酸（L-proline）可降低序列Tm值并提高聚合酶穩(wěn)定性。
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假陽(yáng)性抑制：聚乙烯二醇-納米氧化石墨烯（PEG-nGO）可吸附多余引物，減少非特異性起始；疏水性磁性離子液體（MIL）可濃縮DNA并釋放抑制引物二聚體的金屬離子。
多樣化的檢測(cè)方法學(xué)
LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物或副產(chǎn)物的檢測(cè)方法多樣，各具特色。
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瓊脂糖凝膠電泳：可觀察到階梯狀條帶，但操作繁瑣，氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)高，現(xiàn)多用于區(qū)分非特異性擴(kuò)增。
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比色法：利用反應(yīng)過(guò)程中pH下降（酚紅等染料從粉紅變黃）或Mg2+濃度變化（羥基萘酚藍(lán)HNB從紫變藍(lán)，鈣黃綠素-錳復(fù)合物熒光恢復(fù)）。還有基于焦磷酸酶水解PPi生成磷酸，再與鉬酸銨形成磷鉬藍(lán)復(fù)合物，或基于精胺-二氧化硅-炭黑顆粒導(dǎo)致膠體溶液從黑色不透明變?yōu)橥该魃锨逡旱姆椒āＰ滦腿玖螸SV、LSM顏色對(duì)比度更佳。
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濁度法：通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鎂焦磷酸鹽白色沉淀導(dǎo)致的濁度變化，但穩(wěn)定性短暫。
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側(cè)向流動(dòng)層析（LFD）：利用預(yù)置抗體檢測(cè)帶有生物素、地高辛等標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過(guò)膠體金顯色。可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，但開(kāi)管稀釋步驟有污染風(fēng)險(xiǎn)。集成化的“一次性核酸檢測(cè)裝置”可降低此風(fēng)險(xiǎn)。
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熒光染料：SYBR Green I、GeneFinder、SYTO系列（如SYTO 9、82）、Eva Green等DNA嵌入染料可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)或終點(diǎn)熒光檢測(cè)。不同染料對(duì)擴(kuò)增的抑制作用和信號(hào)背景比不同。
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淬滅探針（Q Probe）：探針與靶序列雜交時(shí)，熒光被序列中的鳥(niǎo)嘌呤淬滅，熒光信號(hào)隨擴(kuò)增進(jìn)行而降低，產(chǎn)生倒S型曲線。
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生物發(fā)光法（BART）：利用擴(kuò)增產(chǎn)生的焦磷酸離子（PPi）在ATP硫酸化酶催化下生成ATP，進(jìn)而觸發(fā)熒光素酶發(fā)光，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。
LAMP與其他技術(shù)的集成
技術(shù)集成旨在提升LAMP的性能和應(yīng)用范圍。
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CRISPR-Cas系統(tǒng)：LAMP擴(kuò)增后，CRISPR-Cas12a/Cas13a對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行特異性識(shí)別并觸發(fā)反式切割活性，切割報(bào)告分子產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)，極大提高特異性，可實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。需解決溫度兼容性（如使用耐熱Cas12b或修飾引物降低反應(yīng)溫度）、Mg2+消耗和pH變化對(duì)Cas酶活性的影響。
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納米材料：金納米顆粒（AuNPs）可作為信號(hào)標(biāo)記（如LFD）或反應(yīng)增強(qiáng)劑（提供熱啟動(dòng)效應(yīng)）。功能化AuNPs（如MUA-AuNPs）可通過(guò)螯合Mg2+導(dǎo)致顏色變化。金納米棒（GNRs）也可用于比色檢測(cè)。
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數(shù)字檢測(cè)：包括芯片式數(shù)字LAMP和微滴式數(shù)字LAMP。將反應(yīng)體系分割成數(shù)千至數(shù)百萬(wàn)個(gè)獨(dú)立單元進(jìn)行平行擴(kuò)增，通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性單元比例實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，靈敏度可達(dá)單分子水平，但設(shè)備要求高。
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RPA/RCA聯(lián)合：RPA或RCA快速生成模板，再由LAMP高效放大信號(hào)，適用于短片段或低豐度靶標(biāo)檢測(cè)，但引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件優(yōu)化復(fù)雜。
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微流控技術(shù)：實(shí)現(xiàn)樣本處理、核酸擴(kuò)增、結(jié)果檢測(cè)的集成化和自動(dòng)化，降低污染，提高通量和便攜性。有基于硅/玻璃的傳統(tǒng)芯片和紙基芯片（2D/3D結(jié)構(gòu)）。
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智能設(shè)備控制：智能手機(jī)/平板與LAMP系統(tǒng)結(jié)合，通過(guò)定制APP、LED光源、攝像頭和機(jī)器學(xué)習(xí)算法，實(shí)現(xiàn)便攜、低成本、高通量的實(shí)時(shí)熒光或比色檢測(cè)與結(jié)果判讀。
LAMP技術(shù)的常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
LAMP技術(shù)的主要挑戰(zhàn)包括假陽(yáng)性和假陰性。
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假陽(yáng)性：主要源于非特異性擴(kuò)增（尤其是引物二聚體）和氣溶膠污染。解決方案包括優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、添加DMSO等增強(qiáng)劑、使用UDG防污染系統(tǒng)、嚴(yán)格分區(qū)操作。
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假陰性：常由反應(yīng)抑制（樣本復(fù)雜成分抑制Bst酶活性）或引物設(shè)計(jì)不佳導(dǎo)致。可通過(guò)樣本稀釋純化、添加BSA、優(yōu)化引物和驗(yàn)證靈敏度來(lái)改善。
標(biāo)準(zhǔn)與最佳實(shí)踐
目前LAMP相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)主要集中于食品檢測(cè)領(lǐng)域（如ISO 24914）。醫(yī)療IVD領(lǐng)域的LAMP產(chǎn)品在歐美主要通過(guò)現(xiàn)有醫(yī)療器械監(jiān)管框架（如歐盟IVDR、美國(guó)FDA 510(k)或EUA）進(jìn)行規(guī)范。
總結(jié)與展望
LAMP技術(shù)作為一種強(qiáng)大的等溫核酸擴(kuò)增工具，在POCT領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。未來(lái)的發(fā)展將集中于解決假陽(yáng)性和氣溶膠污染、簡(jiǎn)化引物設(shè)計(jì)、提高自動(dòng)化程度。通過(guò)深度融合CRISPR、微流控、納米材料、數(shù)字PCR和智能設(shè)備等技術(shù)，LAMP將朝著更高特異性、靈敏度、多重檢測(cè)能力、便攜性和用戶友好性的方向演進(jìn)，在基層醫(yī)療、現(xiàn)場(chǎng)篩查、家庭自測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。下一代分子POCT設(shè)備將更加微型化、多功能集成化，推動(dòng)實(shí)驗(yàn)室精準(zhǔn)診斷向現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)需求的普及。
