《Metabolic Engineering》：Novel routes for bioproduction of delta lactone aroma compounds.
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基因組最小化策略優化布氏桿菌作為異源宿主的生產能力，通過CRISPR-Cas12a刪除p1質粒的spliceostatin合成簇使capistruin產量提升，但單獨刪除p2質粒導致兩種聚酮-非核糖體多肽（PK-NRPs）產量下降，而雙質粒刪除則產量恢復。
Bruno S. Paulo|Sean B. Romanowski|Adjo E. Kadjo|Vitor B. Lourenzon|Alessandra S. Eustáquio
伊利諾伊大學芝加哥分校Retzky藥學院藥學科學系與生物分子科學中心，美國伊利諾伊州芝加哥
摘要
基因組最小化，包括刪除編碼天然產物的內源性基因簇，是提高異源產物產量的常見策略。我們一直致力于將Burkholderia sp. FERM BP-3421開發為替代細菌宿主。我們沒有盲目刪除基因簇（因為這可能會產生不利影響），而是根據生產培養物的轉錄組數據來指導我們的研究。FERM BP-3421的基因組分為兩條染色體和兩個質粒。轉錄水平最高的基因簇分別是質粒p1上的多酮非核糖體肽類spliceostatins和染色體1上的非核糖體肽類selethramide。刪除spliceostatins基因簇后，核糖體肽類capistruin的產量有所提高，而刪除selethramide基因簇對capistruin的產量沒有影響。接下來，我們使用CRISPR-Cas12a技術針對這兩個內源性質粒進行操作，使基因組大小減少了11%。經過質粒改造的菌株生長得到改善，capistruin的產量根據刪除一個還是兩個質粒的不同而增加了20-40%。然而，單獨刪除質粒p2對兩種不同的多酮非核糖體肽類的異源生產產生了負面影響：p2?菌株產生的glidobactin A和megapolipeptin A的產量僅為野生型的5-23%，而在p1? p2?菌株中，產量恢復到了野生型水平。觀察到p2似乎包含支持多酮非核糖體肽類生物合成的功能，這一發現為未來研究這些功能并進一步開展工程改造奠定了基礎。
引言
基因組最小化不僅有助于理解基本生物學機制，還能改善異源宿主的生長性能和生產力（Kim等人，2024年）。通常被刪除的基因包括移動元件、噬菌體和編碼天然產物的生物合成基因簇（BGCs）（Kim等人，2024年）。研究表明，基因組縮減可以提高異源產物的產量（Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Vollmann等人，2025年），并且可能帶來其他意想不到但有益的特性，如提高DNA轉移效率和質粒穩定性（Pósfai等人，2006年）。然而，也可能出現負面現象，例如影響生長（Liu等人，2021年）。
作為基因組縮減的替代方法，有些人選擇使用天然基因組已經最小化的細菌菌株（Zaburannyi等人，2014年）。不過也有觀點認為，擁有更多BGCs的細菌可能更適合生產多種天然產物。例如，最近的研究指出，具有大量BGCs的細菌擁有共同進化的基因，這些基因可以促進天然產物的合成（Wang等人，2024年）。作者們（Wang等人，2024年）鑒定出不同類別的共同進化基因，并證明其中一些基因的表達可以增強不同菌株中的天然產物合成。
非模式細菌越來越多地被用作異源表達（Chan等人，2025年）或內源基因表達（Poppeliers等人，2025年）的平臺。因此，基因組縮減不僅應用于模式細菌如大腸桿菌（Pósfai等人，2006年）和枯草芽孢桿菌（Morimoto等人，2008年），也用于開發替代宿主，如鏈霉菌（Komatsu等人，2010年）和黏細菌（Vollmann等人，2025年）。除了大腸桿菌之外，其他值得注意的假單胞菌屬宿主還包括Cupriavidus necator（Calvey等人，2023年；Della Valle等人，2025年）和Pseudomonas putida（Martínez-García等人，2014年；Martínez-García和De Lorenzo，2016年）。
我們致力于將Burkholderia sp. FERM BP-3421開發為替代異源宿主，以挖掘Burkholderiales和其他β-變形菌的天然產物潛力（Heard和Eustáquio，2025年；Kunakom和Eustáquio，2019年）。從該菌株中分離出的首批天然產物是spliceostatins（如FR901464，圖1A），這是一種用于抗腫瘤治療的拼接調節劑，目前正處于抗體-藥物偶聯物的臨床前開發階段（Kaida等人，2007年；Nakajima等人，1996年；Puthenveetil等人，2016年）。我們選擇FERM BP-3421是因為它之前已被用于工業生產，能夠以g/L的產量提供spliceostatins用于這些臨床前研究（Eustáquio等人，2016年）。另一種從該菌株中分離出的天然產物是selethramide（圖1A），這是一種促進群體運動的脂肽（Romanowski等人，2023年）。
FERM BP-3421的基因組分為兩條染色體和兩個質粒，其中至少包含29個BGCs，這些BGCs分布在所有四個復制子中，編碼天然產物，幾乎是Burkholderia細菌平均15個BGCs的兩倍（Liu和Cheng，2014年）。spliceostatins（fr9）BGC位于質粒p1上，而selethramide（sel）BGC位于染色體1上（圖1B）。另外四個BGCs與已知基因具有相似性，包括編碼鐵載體的orb、抗生素caryoynencin、prn、抗真菌劑aminopyrrolnitrin和抗癌劑romidepsin（Istodax?）；其中只有aminopyrrolnitrin和romidepsin通過質譜法被檢測到（Romanowski等人，2023年）。
在之前將FERM BP-3421開發為異源宿主的努力中，我們獲得了基因組、表觀基因組和代謝組數據集（Romanowski等人，2023年），通過甲基化模擬策略提高了DNA轉移效率（Romanowski等人，2023年），并表征了載體（Fernandez等人，2024年）和啟動子（Adaikpoh等人，2023年）。我們和其他研究人員已經使用這種宿主異源表達了核糖體合成和翻譯后修飾的肽類（RiPPs）（Fernandez等人，2024年；Kunakom和Eustáquio，2020年；Merrild等人，2025年；Nguyen等人，2024年）以及多酮非核糖體肽類（PK-NRPs）（Paulo等人，2024年）。在這些研究中，FERM BP-3421的表現優于大腸桿菌及其天然生產者，突顯了其作為替代宿主的實用性。
在本研究中，我們通過關注內源性BGCs來實現基因組最小化。我們沒有盲目刪除BGCs（因為這可能會產生不利影響），而是根據生產培養物的轉錄組數據來指導研究。我們認為，針對轉錄水平最高的BGCs進行刪除將產生最大影響，同時將減少不必要的影響。由于刪除質粒p1上的fr9 BGC后效果最佳，我們接下來針對內源性質粒進行操作，因為質粒通常編碼非必需基因，且質粒去除后基因組大小減少了11%。然而，令人驚訝的是，刪除質粒p2對PK-NRP的生產產生了負面影響。
化學試劑、酶和實驗程序
PCR所需的寡核苷酸從Sigma-Aldrich購買。T4連接酶由Thermo Fisher提供。用于PCR的限制酶和Q5高保真聚合酶來自New England Biolabs。質粒DNA的提取使用ZR plasmid miniprep試劑盒（Zymo Research）完成，基因組DNA的提取則按照制造商的說明使用GenElute bacterial genomic DNA試劑盒（Sigma-Aldrich）進行。
細菌菌株
Burkholderia sp. FERM BP-3421是從國際專利組織獲得的
染色體1編碼selethramide，質粒1編碼spliceostatins，這些是轉錄水平最高的BGCs
在宿主開發過程中，通過刪除內源性BGCs可以創建一個“干凈”的背景環境。這不僅有助于檢測和分離異源產物，還能提高異源產物的產量（Komatsu等人，2010年；Liu等人，2021年；Vollmann等人，2025年）。我們之前開發了一種基于大豆蛋白胨和甘油的復雜培養基（命名為2S4G），該培養基能夠實現高細胞密度和每升高的內源性產物產量
討論
異源表達有助于加速天然產物的發現。基因組最小化是一種常見的策略，用于去除不必要的基因并提高異源產物的產量（Kim等人，2024年；Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Pósfai等人，2006年；Vollmann等人，2025年）。然而，哪些基因是多余的并不總是明確的，觀察到的效果也可能取決于具體情境。
在基因組最小化過程中經常被刪除的基因包括移動元件等
CRediT作者貢獻聲明
Alessandra Eustaquio：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿，數據可視化，項目管理，方法學研究，資金獲取，數據分析，概念化。Adjo E. Kadjo：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿，數據可視化，驗證，方法學研究，調查，數據分析。Vitor B. Lourenzon：方法學研究，調查，數據分析。Bruno S. Paulo：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿
未引用參考文獻
Hayes, 2003; Riss et al., 2013.
數據可用性
DNA序列已存入NCBI的GenBank數據庫， accession代碼分別為CP196722（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1-）、CP196719（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p2-）、CP196911（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1- p2-）和PV932216（質粒pBS018）。RNA序列的存入代碼為PRJNA1358255。
利益沖突聲明
我們沒有需要聲明的利益沖突。
致謝
我們感謝日本國立技術評估研究所的國際專利機構提供FERM BP-3421菌株；感謝威斯康星大學麥迪遜分校的Brian F. Pfleger提供glidobactin A標準品；感謝法國巴黎國家自然歷史博物館的Séverine Zirah提供capistruin標準品；感謝西蒙弗雷澤大學的Michael Recchia和Roger Linignton提供megapolipeptin A標準品；以及感謝伊利諾伊大學芝加哥分校的Galen Ptacek提供p2 GO術語分析。
