《Advanced Science》：TriCON: A Carbon-Based Triple-Modal Nanoplatform for Pancreatic Cancer Therapy
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本研究開發了一種名為TriCON（三重會聚腫瘤納米療法）的三模態治療平臺，用于胰腺導管腺癌（PDAC）治療。該碳基納米平臺可共同裝載阿霉素（DOX）和CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP），通過編輯脊髓灰質炎病毒受體（PVR）基因、誘導免疫原性細胞死亡（ICD）及激活自然殺傷（NK）細胞，實現時空協同的化療-免疫聯合治療，為改善PDAC免疫抑制微環境（TIME）提供了新策略。
胰腺導管腺癌（PDAC）因其高惡性度和免疫抑制性腫瘤微環境（TIME），對常規治療手段響應不佳。重新編程TIME成為增強腫瘤免疫治療效果的有前景策略。基于CRISPR/Cas9系統的基因編輯為精確調控腫瘤免疫抑制相關內源基因表達提供了可行途徑。然而，現有遞送載體在生物安全性、擴增能力和靶向準確性方面面臨三重挑戰。
TriCON納米平臺的設計與構建
為解決上述挑戰，研究人員開發了TriCON（三重會聚腫瘤納米療法）三模態治療平臺。該平臺具有三個核心機制特性：時空收斂性、刺激響應可控性和腫瘤微環境調節導電性。TriCON以碳基球形納米顆粒（CSN）為核心，通過濕法氧化在其表面引入羥基和羧基以增強功能化。首先將阿霉素（DOX）裝載到中孔CSN中（稱為DOX@CSN）。隨后，將帶負電的Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）與陽離子聚乙烯亞胺（PEI）整合以建立電荷平衡，并通過靜電作用與DOX@CSN結合。最后，在表面包覆對腫瘤細胞有高親和力的細胞穿膜肽（CPP），形成最終的TriCON納米復合物。表征結果顯示，TriCON粒徑約為262納米，zeta電位為+13.4毫伏，具有良好的分散性和穩定性。
藥物釋放與安全性
TriCON在酸性條件下（pH 5.5）表現出顯著的pH響應性藥物釋放特性，86.25%的DOX在pH 5.5的PBS緩沖液中釋放，顯著高于pH 7.4條件下的45.32%。RNP的釋放也表現出類似的pH響應特性。溶血實驗和細胞毒性試驗表明，TriCON具有良好的生物相容性，對正常胰腺細胞（HPDE6C7）的存活率超過85%，且未引發細胞炎癥反應。
細胞攝取與體外效應
細胞攝取實驗表明，TriCON/RNP在6小時與內體共定位，8小時與溶酶體共定位，12小時后能有效逃逸溶酶體，并在細胞核內富集，顯示出強大的溶酶體逃逸能力。與商業脂質體（LIPO/RNP）相比，TriCON顯著增強了Cas9的細胞攝取。DOX在6小時內成功富集于細胞并與細胞核共定位。體外細胞毒性實驗顯示，DOX@CSN-PEI對BxPC3和SW1990細胞具有劑量依賴性細胞毒性作用，其半數抑制濃度（IC50）分別為17.68和30.16微克/毫升。
PVR基因編輯效率
針對胰腺癌細胞中高表達的PVR基因，研究設計了特異性sgRNA。體外實驗證實，TriCON/RNP-PVR能有效敲低PVR表達，其中sgRNA1顯示出優異的敲除效果。T7E1檢測和Sanger測序分析表明，TriCON/RNP-PVR處理組的基因突變頻率超過70%，插入缺失（indel）總效率達77%，顯著高于游離RNP處理組。蛋白質印跡分析進一步證實，TriCON/RNP-PVR組的PVR敲低效率高于脂質體組。
增強NK細胞殺傷作用
研究發現，DOX處理可通過促進活性氧（ROS）釋放上調PDAC細胞中PVR的表達。TriCON/RNP-PVR通過協同沉默PVR增強了DOX的細胞毒性作用。與NK細胞共培養后，TriCON/RNP-PVR + NK處理顯著抑制了腫瘤細胞生長和克隆形成能力。同時，DOX誘導的免疫原性細胞死亡（ICD）顯著增加了高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的表達和細胞外分泌，促進鈣網蛋白（CRT）在細胞膜表面的暴露，并提高細胞內三磷酸腺苷（ATP）濃度。細胞因子檢測顯示，TriCON/RNP-PVR顯著提升了腫瘤細胞中CXCL10、IFN-α1、IL-1β和TNF-α等炎癥細胞因子的表達，以及共培養系統中顆粒酶B（GZB）、IFN-γ等抗腫瘤效應分子的水平。
體內抗腫瘤效果
在SW1990-LUC異種移植瘤模型中，尾靜脈注射TriCON/RNP-PVR聯合NK細胞治療顯著抑制了腫瘤生長，并幾乎消除了腫瘤，顯著提高了小鼠的生存率。體內分布實驗顯示，Cy7標記的TriCON納米顆粒在注射后24小時內在腫瘤部位富集，信號持續至48小時，而游離Cy7染料組未見腫瘤部位熒光富集。 Tunel和Ki-67染色表明，TriCON/RNP-PVR + NK處理組腫瘤細胞凋亡增加、增殖減少。腫瘤組織T7E1檢測顯示PVR基因編輯效率為14.2%，免疫組化證實PVR表達降低。此外，該治療顯著提升了腫瘤組織和血清中TNF-α、GZB、IL-1β和IFN-γ的水平。重要的是，在心、肝、脾、肺、腎、腦等器官中未檢測到PVR基因的脫靶編輯。
原位胰腺癌模型驗證
在免疫正常的C57BL/6小鼠原位胰腺癌（Pan02-LUC）模型中，TriCON/RNP-PVR治療同樣顯著抑制了腫瘤生長。基因組分析證實腫瘤組織中有高效的PVR基因編輯，而主要器官中未檢測到脫靶效應。流式細胞術和多重免疫熒光染色分析顯示，TriCON/RNP-PVR治療組腫瘤組織中NK細胞浸潤水平顯著高于其他組，且NK細胞活化標志物信號更強。這些結果通過qPCR和ELISA得到了進一步驗證。
結論
TriCON納米平臺能夠高效遞送CRISPR/Cas9 RNP，在胰腺癌中特異性編輯PVR免疫檢查點基因，并通過DOX誘導的ICD和NK細胞激活，實現協同抗腫瘤效果。該策略為胰腺癌的免疫聯合基因治療提供了新的框架和臨床轉化前景。
