摘要

引言

基因組最小化不僅有助于理解基本生物學原理，還能改善異源宿主的生長性能和生產力（Kim等人，2024年）。通常被移除的基因包括移動元件、噬菌體和編碼天然產物的生物合成基因簇（BGCs）（Kim等人，2024年）。研究表明，基因組縮減可以提高異源產物的產量（Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Vollmann等人，2025年），并可能帶來其他意想不到但有益的特性，如提高DNA轉移效率和質粒穩定性（Pósfai等人，2006年）。然而，也可能出現不良表型，例如對生長產生負面影響（Liu等人，2021年）。 作為一種替代基因組縮減的方法，有些人選擇使用本身基因組已經高度簡化的細菌菌株（Zaburannyi等人，2014年）。但反對這一觀點的觀點認為，具有更多BGCs的細菌可能更適合生產多種天然產物。例如，最近的一項研究表明，具有大量BGCs的細菌擁有共同進化的基因，這些基因有助于天然產物的生物合成（Wang等人，2024年）。作者們（Wang等人，2024年）鑒定出不同類別的共同進化基因，并證明其中一些基因的表達可以增強不同菌株中的天然產物合成。 非模式細菌越來越多地被用作異源基因表達（Chan等人，2025年）或內源基因表達（Poppeliers等人，2025年）的平臺。因此，基因組縮減不僅應用于模式細菌如大腸桿菌（Pósfai等人，2006年）和枯草芽孢桿菌（Morimoto等人，2008年），還應用于替代宿主的開發，如鏈霉菌（Komatsu等人，2010年）和黏細菌（Vollmann等人，2025年）。除了大腸桿菌之外，其他值得注意的假單胞菌屬宿主還包括Cupriavidus necator（Calvey等人，2023年；Della Valle等人，2025年）和Pseudomonas putida（Martínez-García等人，2014年；Martínez-García和De Lorenzo，2016年）。 我們一直致力于將Burkholderia sp. FERM BP-3421作為替代異源宿主，以挖掘Burkholderiales和其他β-變形菌的天然產物潛力（Heard和Eustáquio，2025年；Kunakom和Eustáquio，2019年）。從該菌株中分離出的首批天然產物是拼接抑制劑類化合物，如FR901464（圖1A），這是一種用于抗體-藥物偶聯物的臨床前開發的剪接調節劑（Kaida等人，2007年；Nakajima等人，1996年；Puthenveetil等人，2016年）。我們選擇FERM BP-3421是因為它之前已被用于工業生產，能夠以g/L的產量提供這些拼接抑制劑（Eustáquio等人，2016年）。另一種從該菌株中分離出的天然產物是selethramide（圖1A），這是一種促進群體運動的脂肽（Romanowski等人，2023年）。 FERM BP-3421的基因組分為兩條染色體和兩個質粒，其中至少包含29個BGCs，這些BGCs分布在四個復制子上，編碼天然產物，幾乎是Burkholderia細菌平均15個BGCs的兩倍（Liu和Cheng，2014年）。拼接抑制劑基因簇（fr9）位于質粒p1上，而selethramide基因簇（sel）位于染色體1上（圖1B）。另外四個BGCs與已知基因簇有相似性，包括編碼鐵載體ornibactin的orb、抗生素caryoynencin的cay、抗真菌胺基吡咯硝胺的prn和抗癌化合物romidepsin的dep（Istodax?）；其中只有胺基吡咯硝胺和romidepsin通過質譜檢測到（Romanowski等人，2023年）。 在之前將FERM BP-3421開發為異源宿主的努力中，我們獲得了基因組、表觀基因組和代謝組數據（Romanowski等人，2023年），通過甲基化模擬策略提高了DNA轉移效率（Romanowski等人，2023年），并表征了載體（Fernandez等人，2024年）和啟動子（Adaikpoh等人，2023年）。我們和其他研究人員已利用該宿主實現了核糖體合成及翻譯后修飾肽（RiPPs）（Fernandez等人，2024年；Kunakom和Eustáquio，2020年；Merrild等人，2025年；Nguyen等人，2024年）和聚酮類非核糖體肽（PK-NRPs）（Paulo等人，2024年）的異源表達。在這些研究中，FERM BP-3421的表現優于大腸桿菌及其天然生產菌株，凸顯了其作為替代宿主的實用性。 在本研究中，我們通過針對內源性BGCs來實現基因組最小化。為了避免無差別地刪除基因簇（這有時會產生不利影響，Liu等人，2021年），我們根據生產培養物的轉錄組數據來指導工作。我們認為，針對轉錄水平最高的BGCs進行刪除將產生最大影響，同時將減少不良影響。由于刪除質粒p1上的fr9 BGC獲得了最佳效果，因此我們接下來針對內源性質粒進行改造，因為質粒通常編碼非必需基因，這樣可以使基因組大小減少11%。然而，令人意外的是，刪除質粒p2對PK-NRP的產量產生了負面影響。

化學試劑、酶和通用實驗程序

用于PCR的寡核苷酸購自Sigma-Aldrich。T4連接酶由Thermo Fisher提供。用于PCR的限制酶和Q5高保真聚合酶來自New England Biolabs。質粒DNA的提取使用ZR plasmid miniprep試劑盒（Zymo Research）完成，基因組DNA的提取則使用GenElute細菌基因組DNA試劑盒（Sigma-Aldrich）按照制造商的說明進行。

細菌菌株

Burkholderia sp FERM BP-3421是從國際專利機構獲得的

染色體1編碼selethramide，質粒1編碼拼接抑制劑，這兩個基因簇的轉錄水平最高

在宿主開發過程中，通過刪除內源性BGCs可以創建一個“干凈”的背景環境。這不僅有助于檢測和分離異源產物，還能提高異源產物的產量（Komatsu等人，2010年；Liu等人，2021年；Vollmann等人，2025年）。我們之前開發了一種基于大豆蛋白胨和甘油的復雜培養基（命名為2S4G），該培養基能夠實現高細胞密度和每升高的內源性產物產量

討論

異源表達有助于加速天然產物的發現。基因組最小化是一種常見的策略，用于去除不必要的功能并提高異源產物的產量（Kim等人，2024年；Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Pósfai等人，2006年；Vollmann等人，2025年）。然而，哪些功能是多余的并不總是明確的，觀察到的效果也可能因具體情境而異。 在基因組最小化過程中，通常會被移除的基因包括移動元件...

CRediT作者貢獻聲明

Alessandra Eustáquio：撰寫——審稿與編輯、初稿撰寫、可視化、項目監督、方法學設計、資金籌集、數據分析、概念化。 Adjo E. Kadjo：撰寫——審稿與編輯、初稿撰寫、可視化、驗證、方法學設計、實驗研究、數據分析。 Vitor B. Lourenzon：方法學設計、實驗研究、數據分析。 Bruno S. Paulo：撰寫——審稿與編輯、初稿撰寫。

未引用的參考文獻

Hayes, 2003; Riss等人，2013.

數據可用性

DNA序列已存入NCBI的GenBank數據庫，訪問代碼分別為CP196722（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1^-）、CP196719（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p2^-）、CP196911（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1^- p2^-）和PV932216（質粒pBS018）。RNA序列的訪問代碼為PRJNA1358255。

利益沖突聲明

我們沒有需要聲明的利益沖突。

致謝

我們感謝日本國立技術評估研究所的國際專利機構提供FERM BP-3421菌株；感謝威斯康星大學麥迪遜分校的Brian F. Pfleger提供glidobactin A標準品；感謝法國巴黎國家自然歷史博物館的Séverine Zirah提供capistruin標準品；感謝西蒙弗雷澤大學的Michael Recchia和Roger Linignton提供megapolipeptin A標準品；以及感謝伊利諾伊大學芝加哥分校的Galen Ptacek提供p2 GO術語分析。