在細菌與病毒永無休止的進化軍備競賽中，CRISPR-Cas系統扮演著關鍵防御角色。其中，CRISPR-Cas13因其獨特性吸引了眾多科學家：它不切割DNA，而是精準靶向并切割RNA。更引人注目的是，其在原核生物中一旦被特定靶RNA激活，便會展現出"不分敵我"的RNA切割能力，即"旁系切割活性"，這被認為能通過誘導細菌休眠來保護群體。然而，當科學家們將Cas13這一利器引入更為復雜的真核細胞（如人類細胞）時，情況變得撲朔迷離。早期研究歡呼其能夠實現比RNA干擾技術更高效、特異的基因敲低，成為RNA研究的新寵。但近年來，一些研究團隊在應用Cas13時卻意外遭遇了細胞毒性問題，暗示著這種旁系切割活性可能在真核細胞中并未完全消失。這種活性究竟是否存在？其動態過程如何？又會引發細胞怎樣的反應？這些問題不僅關乎對Cas13基礎生物學的理解，更決定了其能否安全、有效地應用于未來的基因治療。

為了回答這些問題，由萊頓大學醫學中心的Jorik Frederik Bot、趙志晗等人組成的研究團隊在《Communications Biology》上發表了他們的研究成果。研究人員首先系統比較了六種不同Cas13同源蛋白（LbuCas13a、LwaCas13a等）的體外旁系切割活性，發現LbuCas13a活性最強。當他們通過iTOP（一種利用高滲和丙胺甜菜堿誘導蛋白質胞內遞送的方法）或電轉方式，將LbuCas13a蛋白與引導RNA形成的核糖核蛋白復合物遞送到人細胞中，并靶向高表達的外源（如dEGFP）或內源（如18S rRNA、GAPDH）轉錄本時，觀察到了強烈的總RNA降解現象。這種降解在50分鐘內啟動，200分鐘左右達到高峰，甚至24小時后仍有殘留。這種旁系切割活性在不同細胞系（HAP1、RD、U2OS、ARPE19）中均存在，但程度有異。重要的是，當LbuCas13a通過質粒在細胞內表達時，卻未觀察到類似活性，提示高濃度的RNP遞送是關鍵。

這種大規模的RNA破壞觸發了細胞的強烈應激反應。RNA測序分析顯示，在LbuCas13a激活16小時后，細胞轉錄組發生顯著改變，大量與先天免疫應答相關的基因（如細胞因子、趨化因子相關基因）以及即時早期反應基因（如JUN、FOS、EGR家族）被上調，同時脂肪酸代謝相關通路被抑制。活細胞成像進一步證實，靶細胞會進入凋亡程序，最終死亡。研究人員巧妙地將這一細胞毒性轉化為一種應用優勢：開發了一種靶向RNA的細胞負向篩選工具。通過靶向混合細胞群中特定細胞所高表達的RNA（如EGFP轉錄本或癌基因CDK4），LbuCas13a能有效清除目標細胞，甚至可進行多輪篩選來富集基因編輯成功的細胞。

為了更深入地理解旁系切割的全局影響和分子細節，研究者結合了總RNA測序（使用ERCC外參RNA進行標準化）和納米孔直接RNA測序技術。總RNA測序揭示，LbuCas13a激活導致了近乎全局性的蛋白編碼mRNA損失，中位損失率在200分鐘時超過50%，而線粒體編碼的mRNA和某些核內非編碼RNA（如MALAT1）則相對耐受。納米孔測序不僅直觀展示了轉錄本讀長的大幅縮短，還通過分析轉錄本覆蓋度，發現了大量特異的切割位點。這些位點往往位于預測的莖環結構區域，且傾向于在尿嘧啶殘基附近進行切割，這與LbuCas13a的體外切割偏好一致。

本研究主要運用了以下關鍵技術：1) 多種Cas13同源蛋白的重組表達與純化；2) iTOP滲透壓法和電穿孔法進行核糖核蛋白復合物的細胞內遞送；3) 5‘-3’ RT-qPCR（逆轉錄定量聚合酶鏈式反應）用于定量分析靶RNA與旁系RNA的降解動態；4) 活細胞成像（使用Annexin V和CellTox Green染料）監測細胞凋亡與死亡；5) 總RNA測序結合ERCC（外部RNA控制聯盟）spike-in對照RNA，以準確量化全局轉錄本變化；6) 牛津納米孔長讀長測序用于解析RNA切割位點與結構偏好性。研究所用細胞系包括人近單倍體細胞HAP1、橫紋肌肉瘤細胞RH30/RD、骨肉瘤細胞U2OS以及視網膜色素上皮細胞ARPE19。

研究人員通過生物分析儀檢測總RNA完整性，發現僅在表達dEGFP靶標的HAP1-dEGFP細胞中，LbuCas13a與靶向dEGFP的引導RNA共同轉染后，總RNA圖譜出現了特征性的降解片段，這些片段在18S核糖體RNA峰前形成數個新峰，而在野生型HAP1細胞中則無此現象。通過計算這些降解片段的曲線下面積，確定其豐度在轉染后100-200分鐘達到峰值。5‘-3’ RT-qPCR分析進一步證實，靶RNA（dEGFP）的降解幾乎立即開始，而旁系RNA（GAPDH）的降解啟動稍晚，約100分鐘時達到高峰，500分鐘后恢復。其他測試的Cas13同源蛋白（LwaCas13a, PspCas13b, BzCas13b）僅顯示出微弱的靶RNA降解，旁系切割活性不顯著。

研究證實旁系切割活性不依賴于特定的遞送方法或靶標類型。電穿孔遞送LbuCas13a RNP靶向內源的高豐度轉錄本（RPS19, GAPDH, 18S rRNA）同樣引發了強烈的總RNA降解。然而，當通過質粒轉染使細胞表達LbuCas13a蛋白時，即使能檢測到蛋白表達，也未能誘導出旁系切割活性，強調了高濃度RNP遞送的重要性。

在HAP1、RD、U2OS和ARPE19四種人源細胞系中，靶向18S rRNA、GAPDH或RPS19均能誘導出相似模式的RNA降解，表明旁系切割具有普適性。其中，HAP1細胞表現出最顯著的降解效應，可能與iTOP在該細胞系中遞送效率較高或其近單倍體特性有關。即使在常報道Cas13活性較低的HEK293T細胞中，通過電穿孔遞送靶向GAPDH和18S rRNA也能觀察到降解，盡管程度較輕。

活細胞成像實驗清晰顯示，只有在表達dEGFP靶標的HAP1-dEGFP細胞中，LbuCas13a激活才會導致細胞凋亡：轉染后約7.5小時，早期凋亡標志物Annexin V陽性細胞數顯著增加，約15小時后，死細胞染料CellTox Green陽性細胞數隨之上升，此過程符合凋亡特征，而非壞死。

基于上述發現，研究團隊開發了LbuCas13a的細胞篩選應用。將表達EGFP的HAP1細胞與野生型細胞混合后，用靶向EGFP的LbuCas13a RNP處理，可特異性減少EGFP陽性細胞的比例。多輪篩選能進一步富集陰性細胞。篩選效率與靶RNA的表達水平呈正相關，但在極高表達時可能達到平臺期。此策略成功應用于富集通過Cas12a介導的基因編輯修復了EGFP熒光的細胞，以及特異性清除因基因組擴增而高表達CDK4癌基因的橫紋肌肉瘤RH30細胞。

RNA測序分析發現，LbuCas13a激活16小時后，細胞轉錄組發生劇烈變化，806個基因顯著上調，41個基因下調。上調基因顯著富集于先天免疫應答相關通路，如細胞因子-細胞因子受體相互作用、IL-17信號通路、TNF信號通路和NF-κB信號通路，表明大規模的RNA降解觸發了類似病毒RNA識別后的細胞內免疫反應。

利用ERCC spike-in RNA校正的總RNA測序顯示，在LbuCas13a激活50分鐘和200分鐘后，蛋白編碼轉錄本出現近乎普遍的耗竭，中位log2折疊變化分別達-0.66和-1.18。高豐度轉錄本更易被降解。線粒體mRNA和某些核非編碼RNA則相對穩定。在降解過程中，一些應激反應基因（如FOS, JUN, EGR1）被誘導上調。

納米孔測序直接證實了廣泛性RNA切割：靶向dEGFP的樣本中，長讀長（>1000 nt）轉錄本數量急劇減少。轉錄本覆蓋度分析揭示了靶RNA原型間隔區附近的特異性切割，以及在眾多非靶mRNA和胞質非編碼RNA上存在的重復出現的切割位點。這些位點常位于預測的莖環結構的單鏈環區，且偏好切割尿嘧啶殘基，與LbuCas13a的體外特性一致。

本研究詳細描繪了LbuCas13a在人細胞中誘導靶向和旁系RNA切割的時間動態圖譜。其旁系切割活性導致胞質RNA近乎全局性耗竭，進而觸發強烈的先天免疫應答和細胞凋亡。研究表明，Cas13旁系活性的顯現取決于多個因素：同源蛋白的固有活性、細胞內RNP濃度、靶RNA表達水平以及細胞系特異性差異。該研究不僅深化了對Cas13在真核環境中行為的理解，更重要的是，它將這種"副作用"轉化為一種強大的應用工具，實現了基于特定RNA表達水平的靶向細胞清除，為基因治療、癌癥治療（特別是針對過表達癌基因的腫瘤）和細胞工程中的負向篩選提供了新的精準手段。未來，通過蛋白質工程優化Cas13活性、探索更優的遞送策略以及結合細胞周期同步化等方法，有望進一步提升其篩選效率和特異性。