《Microbial Biotechnology》：Exploiting the Endogenous Type II-A CRISPR-Cas System for Functional Engineering of Probiotic Lacticaseibacillus rhamnosus GG
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本研究成功開發并驗證了基于鼠李糖乳桿菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG, LGG）內源性II-A型CRISPR-Cas系統的基因組編輯平臺。該平臺通過精確鑒定PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列為5′-NGAAA-3′，并構建合成sgRNA（single-guide RNA）表達盒與同源定向修復（Homology-Directed Repair, HDR）模板，實現了LGG中靶向基因刪除（如fucI, acs1）和插入（如cat, gusA），編輯效率達11.1%-25.0%。研究進一步構建了表達β-葡萄糖醛酸酶（GusA）的LGG工程菌株，證實其可用于復雜微生物群落中的菌株追蹤，為LGG作為下一代益生菌（next-generation probiotics）在食品生物技術和微生物療法中的應用提供了強大工具。
利用內源性II-A型CRISPR-Cas系統對益生菌鼠李糖乳桿菌GG進行功能性工程化改造
引言
鼠李糖乳桿菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG, LGG）是研究最廣泛的益生菌株之一，因其對胃酸和膽鹽的強耐受性、良好的腸道上皮粘附性以及公認的安全性（GRAS status），被廣泛應用于食品和臨床領域。然而，缺乏高效、精確的基因組編輯工具嚴重限制了對其益生機制的研究和功能菌株的開發。盡管異源CRISPR-Cas9系統已成功應用于部分乳酸菌，但其存在質粒穩定性差、轉化效率低、細胞毒性等問題。近年來，利用宿主內源性的CRISPR-Cas系統進行基因組編輯顯示出更好的兼容性和更低的細胞毒性。LGG基因組中含有一個完整的II-A型CRISPR-Cas基因座，包括cas1, cas2, csn2和cas9基因以及一個包含24個間隔子的CRISPR陣列。本研究旨在利用LGG的這套內源性系統，建立一個精確、高效的基因組編輯平臺。
PAM序列特異性驗證
研究首先通過質粒干擾實驗結合單核苷酸替換，確認了LGG內源性II-A型CRISPR-Cas系統所識別的PAM序列為5′-NGAAA-3′。實驗表明，該PAM序列具有嚴格的核苷酸偏好性，其中第2位點的鳥嘌呤（G）和第4位點的腺嘌呤（A）對于有效的Cas9切割至關重要。
編輯質粒的構建與優化
研究人員構建了基于復制型質粒pTRK870的編輯系統。初期嘗試使用天然的crRNA（CRISPR RNA）表達盒，但由于滾環復制質粒的不穩定性，間隔子區域易在質粒復制過程中丟失，導致高頻率的野生型菌株存活。為解決此問題，研究轉向使用人工設計的單鏈向導RNA（sgRNA），將crRNA和tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）通過一個AAUC環連接起來，并在乳酸桿菌NCFM來源的強組成型啟動子Ppgm控制下表達。針對16S rRNA基因的sgRNA質粒轉化LGG后，可轉化子數量顯著減少，證明了該人工sgRNA能被內源性Cas9蛋白有效識別并介導染色體切割。
實現靶向基因刪除
為驗證編輯系統的有效性，研究首先靶向刪除L-巖藻糖異構酶編碼基因fucI（LGG_02685）。構建了同時表達靶向fucI的sgRNA和攜帶1 kb同源臂修復模板的編輯質粒pfucI-sgRNA-RT。轉化LGG后，在回收的轉化子中，通過PCR篩選和測序驗證，成功獲得了一株ΔfucI突變株（MJM568），編輯效率為25%（1/4）。表型分析證實，MJM568無法以巖藻糖作為唯一碳源生長。此外，研究還成功刪除了一個更大的1.5 kb基因組區域（CoA合成酶基因acs1），編輯效率為23.1%（3/13），證明了該系統處理不同長度缺失的能力。
實現靶向基因插入
為進一步測試系統的基因插入能力，并克服原始質粒骨架的局限性，研究構建了更小、更穩定的新編輯骨架pMJM100。利用此骨架，成功將氯霉素抗性基因（cat）表達盒插入到fucI基因位點，替換掉其640 bp片段，編輯效率為16.7%（1/6），獲得菌株MJM655。該菌株表現出氯霉素抗性，而野生型LGG則敏感。
構建GUS陽性LGG菌株及應用示范
作為功能應用示范，研究將來源于格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）ADH的β-葡萄糖醛酸酶基因（gusA）表達盒整合到LGG基因組中fucose和rhamnose操縱子之間的 intergenic 區域，編輯效率為11.1%（1/9），獲得菌株MJM670。該菌株在含有X-Gluc的培養基上形成藍色菌落，而野生型為白色，證實了gusA的成功表達。與質粒攜帶的gusA相比，染色體整合的gusA表達在連續傳代中表現出極高的穩定性。生長曲線顯示，gusA的插入未影響相鄰糖利用操縱子的功能。
體內追蹤GUS陽性LGG
通過小鼠灌胃實驗評估工程菌株MJM670在胃腸道內的存活和定殖情況。灌胃后12小時，糞便中可檢測到約107CFU/g的活菌，24小時后降至約105CFU/g，48小時后基本清除。qPCR檢測的總LGG（活菌+死菌）動態與活菌計數結果相似，表明工程菌株與野生型LGG在體內的存活動力學無顯著差異，均表現為短暫定殖。基于GUS活性的平板計數法能特異性檢測活菌，為研究工程益生菌在復雜微生物環境中的行為提供了有力工具。
討論與總結
本研究成功建立了基于LGG內源性II-A型CRISPR-Cas系統的基因組編輯平臺。該系統編輯效率（11.1%-25.0%）雖非最高，但足以滿足常規菌株構建需求，且編輯質粒易于消除，最終菌株無疤痕、無抗性標記，符合食品和 therapeutic 應用要求。所構建的GUS陽性LGG菌株為益生菌在復雜微生物群落和宿主體內的追蹤研究提供了可靠模型。該平臺清除了LGG基因工程化的障礙，擴展了益生菌CRISPR工具包，為開發用于食品生物技術、精密發酵和活體生物治療劑的下一代功能性益生菌奠定了基礎。
