《Talanta》：Toehold-Mediated Strand Displacement in CRISPR/Cas12a Reactions: Advances in Programmable and Universal Biosensing Strategies
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CRISPR/Cas12a結合TMSD技術通過動態調控核酸雜交解決檢測特異性、普適性及靈敏度問題，實現核酸和非核酸靶標的高效識別，拓展了分子診斷在生物醫學、環境監測等領域的應用。
大衛·塞普蒂安·蘇曼托·馬爾龐|阿尤·奧辛·亞普·西納加
生物系統工程系，蘇門答臘理工大學，Terusan Ryacudu街，Way Huwi，Jati Agung區，南蘭普ung，蘭普ung，35365，印度尼西亞
摘要
基于CRISPR/Cas12a的生物傳感器由于其可編程性、高靈敏度和多功能性，已成為核酸檢測的強大工具。然而，諸如PAM依賴性、有限的錯配識別能力以及難以檢測非核酸分析物等挑戰限制了它們的通用性。通過足印介導的鏈置換（TMSD）提供了一種可編程機制，可以通過動態調節雜交動力學和分子相互作用來克服這些限制。本綜述系統地總結了將TMSD整合到CRISPR/Cas12a系統中的最新進展，包括crRNA釋放、crRNA–DNA激活、激活劑生成和報告信號調節。通過將TMSD的精確鏈交換能力與Cas12a的轉切割活性相結合，這些混合生物傳感器實現了更高的特異性、可調的動力學和多分析物適應性。綜述進一步討論了設計原理、熱力學基礎以及在生物醫學、環境和食品診斷中的應用實例。總體而言，TMSD輔助的CRISPR/Cas12a生物傳感提供了一個通用的、可編程的框架，用于下一代分子診斷，具有增強的控制、靈敏度和功能多樣性。
引言
準確和靈敏地檢測分析物對于推進生物醫學、環境和食品診斷至關重要，因為它直接影響人類健康、安全和可持續性。在生物醫學領域，快速識別核酸、蛋白質和代謝物等生物標志物可以實現早期疾病診斷、個性化醫療和有效的治療監測（1），（2）。環境監測依賴于精確的分析物檢測來評估污染物、病原體和毒素，從而確保生態系統保護和公共衛生（3），（4）。同樣，在食品安全方面，檢測污染物、過敏原和摻假物對于質量控制和消費者保護至關重要（5），（6）。這些應用共同強調了創新生物傳感技術在提供可靠、及時和成本效益高的解決方案方面的重要性，以保障健康并促進全球福祉。
成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）–Cas系統是分子生物學中的重要工具。在各種Cas酶中，基于CRISPR–Cas12a的檢測方法最近因其高靈敏度和對多種分析物的廣泛適用性而受到廣泛關注，包括生物系統中的核酸和非核酸目標（7），（8），（9），（10）。對基于CRISPR/Cas12a的檢測方法的需求不斷增加，因為其激活可以通過單鏈DNA（ssDNA）或雙鏈DNA（dsDNA）觸發（11），（12），（13）。此外，激活的Cas12a酶對ssDNA報告分子表現出轉切割活性，使其能夠與熒光、電化學、比色和其他基于傳感器的讀數格式兼容（14），（15），（16），（17）。從2018年至今，關于基于CRISPR/Cas12a的生物傳感器的研究論文數量穩步增長，使用“CRISPR Cas12a Biosensor”關鍵詞在Scopus數據庫中索引了683篇文章，使用“CRISPR Cas12a detection”關鍵詞的文章有2,400篇（圖1A）。在研究領域方面，化學、生物化學、遺傳學和分子生物學、工程學、醫學、物理學和天文學、材料科學、化學工程、農業和生物科學、環境科學、免疫學和微生物學等多個學科與CRISPR/Cas12a生物傳感器研究密切相關（圖1B）。這種日益增長的興趣突顯了基于CRISPR/Cas12a的檢測方法在生物醫學、環境和食品分析中的關鍵作用，為理解檢測機制、疾病預防、污染物監測和風險緩解提供了堅實的基礎。不斷擴大的研究工作反映了人們對改進健康和安全質量的創新解決方案的日益增長的需求（9），（18）。
盡管CRISPR/Cas12a生物傳感器具有諸多優勢并受到廣泛關注，但仍存在一些限制，如目標識別特異性受限和通用檢測方面的挑戰。Cas12a通過含有原間隔序列（PAM）的雙鏈DNA進行酶促激活，并對單核苷酸錯配（SNMs）表現出強烈的選擇性，尤其是在PAM位點附近時（19），（20），（21）。然而，仍然存在一些障礙，包括PAM附近突變的罕見性（22）、低擴增效率（23）以及在使用PAM插入策略進行SNM檢測時產生的缺陷擴增子（19），（23）。當使用單鏈（ss）寡核苷酸作為激活劑時，Cas核酸酶對SNMs的耐受性更強，從而能夠實現激活（19）。總之，雖然雙鏈DNA底物在通用性和靈活性方面有限，但ssDNA激活劑在SNM檢測中的特異性和選擇性較差。
除了目標識別方面的挑戰外，CRISPR/Cas12a系統在檢測某些分析物（如RNA和非核酸目標）時也會遇到困難。例如，RNA檢測通常需要逆轉錄步驟（24），這引入了額外酶的需求，增加了成本和檢測時間。同樣，非核酸檢測通常依賴于間接策略，其中激活劑與分析物相互作用，這些策略必須仔細設計以滿足CRISPR/Cas12a的有效激活要求（25），（26）。足印介導的鏈置換反應（TMSD）為這些挑戰提供了有希望的解決方案，使得能夠更靈活、可編程和高效地檢測多種分析物。
TMSD反應在CRISPR/Cas12a系統中的應用提供了一種強大的策略，以實現多種分析物的特異性和通用檢測。TMSD通過設計的足印結構域可編程地控制核酸相互作用，從而引發鏈置換并觸發下游反應（27），（28）。當與CRISPR/Cas12a結合時，TMSD可以調節激活劑的釋放、生成CRISPR的RNA（crRNAs）或放大報告信號，從而提高系統的整體靈敏度和靈活性。這種組合不僅改善了目標識別，還拓寬了CRISPR/Cas12a生物傳感器在檢測核酸和非核酸目標方面的應用范圍，為診斷和環境監測提供了多功能平臺。
雖然有關TMSD（27），（29），（30），（31），（32），（33），（34），（35），（36），（37），（38），（39）和CRISPR/Cas12a生物傳感器（9），（10），（40），（41），（42），（43），（44），（45），（46），（47），（48），（49），（50）的綜述文章很多，但關于將TMSD整合到CRISPR/Cas12a系統中的專門討論仍然不足。因此，本綜述的目的是討論將TMSD與CRISPR/Cas12a反應結合用于檢測多種分析物的當前生物傳感器。已經將多種TMSD策略整合到CRISPR/Cas12a生物傳感中，包括crRNA生成、酶促激活、激活劑擴增和報告信號放大。此外，本綜述還探討了這些方法的優點和挑戰。總體而言，它提供了TMSD輔助CRISPR/Cas12a診斷的全面概述，為未來的研究和開發提供了指導。
TMSD的熱力學原理和生物傳感應用
TMSD反應從根本上受到核酸雜交熱力學和動力學原理的支配（29），（31），（33）。該過程始于成核步驟，其中入侵鏈（I）與基底–現有雙鏈（S–B）上的暴露單鏈足印結構域（T）雜交。這一步在能量上是有利的，因為它建立了多個沃森-克里克氫鍵和堆疊相互作用。隨著長度和GC含量的增加，吉布斯自由能（ΔG）降低
TMSD驅動的crRNA序列釋放
TMSD提供了一種可編程的機制，用于控制crRNA序列的釋放或組裝（圖2A）。在這種方法中，crRNA鏈最初被隔離或阻斷在包含足印區域的互補DNA/RNA結構中。當特定的觸發劑（如目標核酸或來自DNA電路的中間鏈）與足印區域結合時，它會引發鏈置換并誘導堿基配對的重排，從而釋放crRNA
結論與展望
總之，將TMSD與CRISPR/Cas12a技術相結合代表了生物傳感領域的一項重大進展，因為它將核酸電路的可編程性和精確性與Cas12a的強大酶活性結合起來。通過采用多種策略，包括TMSD驅動的crRNA釋放、crRNA–DNA激活、激活劑生成和報告信號放大，這種混合系統實現了卓越的靈敏度、特異性和適應性，能夠檢測廣泛的分析物
CRediT作者貢獻聲明
阿尤·奧辛·亞普·西納加：撰寫——審稿與編輯，撰寫——原始草稿，概念構思。大衛·塞普蒂安·蘇曼托·馬爾龐：撰寫——審稿與編輯，撰寫——原始草稿，監督，資源，方法論，研究，概念構思
利益沖突聲明
不存在可能影響研究工作的競爭性財務或個人關系
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能會影響本文所述的工作。
致謝
作者感謝蘇門答臘理工大學對這項研究的支持。
