無需擴增的快速RNA檢測方法：通過將CRISPR-Cas13a與級聯擴增DNA酶（RAPID）電路結合實現
《Analytica Chimica Acta》：Amplification-free one-pot RNA detection by pairing C
RISPR–
Cas13a with c
ascade am
plification c
ircuit-driven
DNAzyme (RAPID)
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時間：2026年01月22日
來源：Analytica Chimica Acta 6
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本研究開發了一款基于CRISPR-Cas13a和DNAzyme的快速、無需預擴增的RNA檢測平臺，可在37℃恒溫下30分鐘內實現高靈敏度（5 fM）和特異性的病原體檢測，適用于POC診斷。
尹曉娜|張子妍|羅浩|秦曉琳|陳陽|陳文濤|鄭和平
中國南方醫科大學皮膚病醫院，廣州510091
摘要：
RNA已成為診斷多種病原體的多功能靶標。在即時檢測（POC）或資源有限的環境中，對快速準確診斷的需求正在增長。然而，大多數基于RNA的檢測方法依賴于逆轉錄和復雜的儀器（例如RT-qPCR），這限制了它們在這些環境中的使用。等溫擴增方法提供了一種更簡單的替代方案，所需的儀器較少，但其高擴增效率引發了關于核酸交叉污染的擔憂。為了解決這些挑戰，我們開發了RAPID（CRISPR–Cas13a與級聯擴增電路驅動的DNA酶），這是一種等溫、一鍋法RNA檢測生物傳感平臺，無需樣品預擴增。RAPID結合了CRISPR–Cas13a的精確目標識別和通過腳手架介導的鏈置換DNA電路實現的強大信號放大，從而消除了逆轉錄和熱循環的需要。該平臺能夠在37°C下30分鐘內實現定量RNA檢測。通過重新編程RAPID crRNA，我們成功檢測到了細菌（例如梅毒螺旋體（Treponema pallidum）和淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）以及病毒（例如單純皰疹病毒）目標。RAPID平臺設計用于多種檢測，兼容熒光檢測（RAPID-Flu）和側向流動檢測（RAPID-LFA）讀數。RAPID-Flu和RAPID-LFA的靈敏度均為每反應5 fM，顯示出可比的檢測限。這兩種方法都表現出優異的特異性，并與淋病奈瑟菌的臨床診斷高度一致。總之，RAPID平臺提供了快速、可編程且直觀解釋的解決方案，在POC診斷中具有巨大潛力。其靈活性和便攜性使其特別適合早期診斷和現場監測多種傳染性病原體。
引言
RNA在傳染病監測和臨床診斷中作為一種多功能檢測靶標[1]，應用于多種病原體，如SARS-CoV-2[2]、登革熱病毒[3]和結核分枝桿菌（16S rRNA）[4]。因此，迫切需要快速、簡單且靈敏的RNA檢測方法來支持及時的臨床診斷和疫情控制。盡管逆轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）由于其高分析靈敏度[5]仍然是臨床實踐中RNA檢測的金標準，但它涉及多個步驟，包括逆轉錄和PCR擴增[6]。笨重的熱循環儀、耗時的工作流程和需要培訓的人員限制了其在快速檢測和即時檢測中的應用[7]。
盡管已經開發了幾種等溫RNA檢測方法，如滾環擴增（RCA）[8]、同時擴增和檢測（SAT）[4]以及環介導的等溫擴增（LAMP）[9]，這些方法在恒定溫度下運行，但它們通常需要復雜的引物設計和多種酶。這些要求增加了系統的復雜性和成本，并增加了假陽性結果的可能性[10]。此外，擴增產物的積累會增加背景信號，從而降低檢測靈敏度[11]、[12]。
最近，CRISPR/Cas（規律間隔短回文重復序列/CRISPR相關蛋白）系統在檢測傳染性病原體方面顯示出巨大潛力，可提供單堿基分辨率[13]、[14]、[15]。它已被有效應用于檢測寨卡病毒[16]、埃博拉病毒[17]、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）[18]和梅毒螺旋體（Treponema pallidum）[19]等病原體。諸如SHERLOCK等技術將重組酶聚合酶擴增（RPA）與CRISPR–Cas13a結合，提供了高度敏感和特異的檢測，包括單分子分辨率[20]。然而，這些多步驟操作增加了檢測時間和污染風險。盡管已經開發了一鍋法格式，但RPA混合物的高粘度可能會抑制Cas13a的活性，顯著降低靈敏度[21]。因此，繞過預擴增的基于CRISPR的檢測方法已成為診斷研究的主要焦點。
對于無需酶預擴增的檢測方法來說，獲得足夠的信號并將信號可靠地轉換為可量化的讀數是一個主要挑戰。腳手架介導的鏈置換（TMSD）是一種強大的無酶、等溫信號放大策略，用于構建動態DNA電路和納米結構[22]、[23]。值得注意的是，TMSD在室溫下無需酶即可操作[22]、[23]。TMSD驅動的循環已在生物傳感和核酸電路中得到廣泛探索。例如，Wang等人報道了一種用于數字miRNA檢測的目標循環擴增過程（TRAP），其中腳手架介導的鏈置換實現了高效的循環以提高靈敏度[24]。此外，RNA切割DNA酶是合成的單鏈DNA催化劑，在金屬離子輔因子的存在下切割RNA，提供了另一種信號生成途徑[25]、[26]。具體來說，10–23 DNA酶包含一個15個核苷酸的催化核心，兩側各有一個底物結合臂，在接近生理條件下切割RNA的嘌呤-嘧啶（rR–rY）連接處；與其他基序（如8–17，通常偏好AG連接）相比，10–23具有更廣泛的目標選擇性和良好的性能記錄，便于合理設計臂[27]、[28]。它們的穩定性、可編程性和在等溫條件下的活性[29]使DNA酶成為創新核酸檢測平臺中目標識別和信號生成的高價值組件[30]、[31]。這些方法通過將DNA酶讀數與TMSD驅動的DNA電路結合來放大信號，解決了僅使用CRISPR檢測的靈敏度限制。
在這項研究中，我們開發了RAPID，這是一種CRISPR–Cas13a耦合的級聯擴增、電路驅動的DNA酶放大器，用于快速、無需預擴增的RNA檢測平臺。這種一鍋法、等溫平臺結合了CRISPR–Cas13a的精確目標識別和DNA酶電路的信號放大，實現了快速周轉和簡化操作，無需電化學傳感器或微流控設備。集成設計允許在封閉管中操作，并支持熒光（RAPID-Flu）和視覺側向流動檢測（RAPID-LFA）讀數，適用于即時檢測（POC）。我們通過實施針對病毒（單純皰疹病毒1型，HSV-1）和細菌（梅毒螺旋體和淋病奈瑟菌）RNA目標的crRNA集，證明了RAPID工作流程的可行性。為淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）提供了全面的分析和臨床驗證，而HSV-1和梅毒螺旋體（T. pallidum）作為同一檢測化學中的概念驗證目標進行了評估。針對淋病奈瑟菌16S rRNA[4]，RAPID在合成樣本中實現了高靈敏度和特異性，并在臨床泌尿生殖道拭子樣本中表現出穩健的性能。
材料與設備
HiScribe? T7快速高產量RNA合成試劑盒、Q5?高保真2× Master Mix和RNase抑制劑購自New England Biotechnology。LwaCas13a核酸酶購自GenScript Biotechnology。Tris-HCl（1 M，pH 7.5）、MgCl2（1 M）和RNAlater穩定溶液購自Thermo Fisher Scientific Co。RNeasy Mini Kit購自QiAGEN。NaCl（2 M）、GelRed（10000×）、TBE緩沖液預混粉（1×）、6×甘油凝膠加載緩沖液和DEPC處理的水
RAPID平臺原理
RAPID檢測平臺的原理如圖1所示。由于Cas13a具有優先切割尿嘧啶核苷酸（rU）[13]、[37]的旁路切割活性，我們設計了一個含有五個rU殘基的DNA發夾結構，使激活的Cas13a可以選擇性地切割發夾中的rU區域。發夾的3’端攜帶一個23個核苷酸的觸發序列，啟動下游的TMSD驅動的DNA級聯擴增電路，而部分互補性
結論
在這項研究中，我們開發了RAPID，這是一種一鍋法、無需預擴增的等溫RNA檢測生物傳感平臺。通過將CRISPR–Cas13a的精確目標識別與TMSD驅動的DNA酶放大器的級聯擴增相結合，RAPID實現了高分析特異性和靈敏度，并在臨床樣本檢測中與參考臨床檢測方法完全一致。盡管已有概念相關的Cas13a–DNA電路/DNA酶檢測方法被報道，但這些方法
CRediT作者貢獻聲明
陳陽：軟件編寫。
陳文濤：寫作——審稿與編輯、監督、資金獲取。
鄭和平：寫作——審稿與編輯、監督、項目管理、資金獲取。
尹曉娜：寫作——初稿撰寫、方法學設計、數據管理、概念構思。
張子妍：寫作——初稿撰寫、實驗設計。
羅浩：數據可視化、方法學設計、數據分析。
秦曉琳：資源準備
利益沖突聲明
作者聲明以下潛在的利益沖突：鄭和平和尹曉娜是與中國專利（專利號ZL 2024 1 1081343.5）相關的發明人，該專利涵蓋了RAPID平臺的某些方面。其余作者沒有需要聲明的利益沖突。
數據可用性
數據將根據請求提供。
利益沖突聲明
? 作者聲明以下可能被視為潛在利益沖突的財務利益/個人關系：鄭和平擁有專利號ZL 2024 1 1081343.5；尹曉娜也擁有該專利。如果有其他作者，他們聲明沒有已知的可能會影響本文所述工作的財務利益或個人關系。
致謝
本工作得到了國家自然科學基金（編號：82302579）和廣州市科技計劃項目（編號：202201000007）的支持。資助方未參與研究設計、數據收集與分析、發表決定或手稿準備。我們衷心感謝南方醫科大學皮膚病醫院的臨床實驗室慷慨提供用于本研究的臨床樣本。
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