《Journal of Integrative Plant Biology》：Enhanced exonuclease–Cas9 systems promote multiple nucleotide deletions with higher efficiency and broader targeting scope in plants
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該研究構建“外切酶-DBD-Cas9”融合平臺（MND-Cas9v2），在保持編輯效率同時，將水稻缺失片段從1–2 bp拓展至6–18 bp，并兼容NGN PAM，實現miRNA（OsMIR530）與3′UTR（OsGhd2）大片段缺失，顯著增大籽粒，為植物非編碼區功能解析與精準育種提供通用工具。
研究背景
傳統CRISPR-Cas9在植物中主要產生1–2 bp的小插入缺失（indels），難以破壞miRNA莖環、啟動子順式元件或UTR中的結構序列，限制了對非編碼區功能的深度解析。為此，作者提出“讓Cas9切得更大”的思路，借助外切酶（exonuclease）持續啃食3′末端，誘導更大范圍的缺失。
MND-Cas9v1誕生
團隊首先把四種外切酶——RecJ（5′→3′）、T5（5′→3′）、SbcB（3′→5′）、TREX2（3′→5′）——分別融合到SpCas9的N端，發現只有3′→5′方向的SbcB和TREX2能把缺失峰值從1–2 bp推到6–12 bp，且編輯效率與野生型Cas9持平，由此確立第一代“多重核苷酸缺失Cas9”（MND-Cas9v1）。
DBD“膠水”升級v2
受堿基編輯器中DNA結合域（DBD）可延長單鏈DNA暴露時間的啟發，作者在SbcB/TREX2與Cas9之間插入DBD模塊，構建SbcB-DBD-Cas9與TREX2-DBD-Cas9。水稻原生質體驗證顯示，v2版本同時提升編輯效率與缺失長度：缺失分布拓展至5–18 bp，效率最高提升2.3倍，實現“切得大且切得快”。
PAM松綁——NGN時代
為擺脫NGG PAM限制，作者把v2架構嫁接到Cas9-NG（NGN PAM）與SpG（NGN PAM）骨架，獲得MND-Cas9-NG/SpG v2。八個水稻內源位點測試表明，TREX2-DBD-Cas9-NG在NGA、NGC、NGT、NGG四類PAM均保持高效率，缺失范圍同樣拓寬至5–15 bp，理論可靶向基因組位點增加4倍。
實戰一：敲除miRNA讓籽粒“長胖”
OsMIR530通過抑制靶基因OsPL3負向調控籽粒大小。常規Cas9僅能產生3 bp內小突變，難以破壞miRNA前體莖環。作者用MND-Cas9v2單次導向，獲得7–19 bp缺失的三種純合突變體。RNA二級結構預測顯示突變體莖環完全解體，成熟miRNA無法加工；qRT-PCR顯示OsPL3表達上調2.5–3.1倍，籽粒長度、寬度均顯著增加，而株高與分蘗數不變，證明“切大片段”策略可精準敲除miRNA且不擾動整體發育。
實戰二：刪掉UTR“剎車”元件解除翻譯抑制
OsGhd2的3′UTR含一個SMITE（小反向重復轉座子）莖環，可抑制翻譯。作者設計雙sgRNA完全刪除SMITE（m01）或單sgRNA部分破壞莖環（m02、m03），獲得缺失12–28 bp的突變體。表型上籽粒顯著增大，但mRNA水平無變化；雙熒光報告實驗（ZsGreen/mCherry）顯示，突變3′UTR的翻譯效率提高1.6–1.9倍，直接證實SMITE通過結構而非轉錄水平抑制翻譯，也展示MND-Cas9v2在調控元件精細解剖中的威力。
安全性評估
在可觀察范圍內，最大缺失僅42 bp（原生質體）與28 bp（穩定系），未出現kb級大片段丟失，提示外切酶融合并未誘導極端刪除；脫靶風險與Cas9-NG/SpG本體相當，需后續全基因組測序確認。
未來展望
MND-Cas9v2系統已覆蓋NGG與NGN PAM，理論上可拓展至SpRY（NRNH PAM）或Cas12a（TTV PAM）骨架，實現“全PAM覆蓋”。其高效缺失特性亦適用于啟動子區域多轉錄因子結合位點的一次性切除、長鏈非編碼RNA（lncRNA）模塊刪除及合成生物學中的精細底盤構建。隨著平臺載體已向Addgene提交，全球植物育種實驗室可快速復現并二次開發，為下一代“非編碼區驅動的智能育種”提供通用手術刀。
