《Sensors and Actuators B: Chemical》：Portable biosensor for microRNA-21 based on the regulation of charge density in microchannel through CRISPR/Cas13a system using multimeter as readout
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本研究設計了一種基于CRISPR/Cas13a系統和微通道電阻傳感器的便攜式生物傳感器，用于高靈敏度檢測血清中的miRNA-21。通過CRISPR/Cas13a激活后，發夾DNA探針的斷裂引起微通道表面電荷密度變化，導致電阻可測量變化。優化后，傳感器檢測限達1.41 fM（S/N=3），線性范圍100 fM至10 nM，并成功應用于血清樣本檢測。
Jiexin Wu|Xiaoli Huang|Huabin Cai|Yiwei Xu|Xinjia Wang|Cuiying Lin|Fang Luo|Zhenyu Lin
中國福建省福州市福州大學化學學院，食品安全與生物學分析科學教育部重點實驗室，福建省食品安全與健康分析與檢測重點實驗室
摘要
微小RNA（microRNAs）作為重要的生物標志物，在腫瘤的早期診斷和預后評估中具有巨大潛力。開發使用簡單設備的高精度和靈敏度微小RNA檢測策略至關重要。在本研究中，選擇微小RNA-21作為模型目標，利用微通道的電阻變化作為檢測指標，通過萬用表可以輕松監測這一變化。首先在微通道內壁修飾了發夾DNA探針，由于其磷酸骨架帶有大量負電荷，能夠吸引電解質中的陽離子聚集在通道附近區域，形成高濃度的陽離子區，從而提高離子遷移速率并降低微通道的電阻。微小RNA-21的存在可以激活CRISPR/Cas13a系統，導致修飾后的DNA探針被切割，改變內表面電荷密度，進而增加電阻，這一變化可以通過萬用表檢測到。在優化條件下，微通道電阻與微小RNA-21濃度呈線性關系，檢測范圍為100 fM至10 nM，檢測限達到1.41 fM（信噪比=3）。該傳感器已用于血清樣本中目標微小RNA的檢測，并取得了滿意的結果。
引言
微小RNA（miRNAs）是一類長度約為18–25個核苷酸的小型非編碼RNA，對轉錄后的基因表達調控起著關鍵作用。它們在細胞增殖、分化和程序性細胞死亡等多種生理和病理過程中發揮著重要作用[1]、[2]。越來越多的證據表明，特定微小RNA的失調與多種人類疾病密切相關，包括癌癥、神經系統疾病和代謝異常[3]。因此，微小RNA被廣泛認為是具有臨床價值的生物標志物，在腫瘤早期檢測和預后評估方面具有巨大潛力[4]、[5]。然而，由于其分子量小、序列相似度高以及含量極低，其檢測技術仍然具有挑戰性，導致靈敏度不足、操作復雜且依賴專用儀器。盡管主流檢測方法（如qRT-PCR[6]、Northern blotting[8]、microarray分析[10]）具有較高的分析精度，但這些方法通常耗時較長，需要復雜的儀器，無法滿足即時診斷或快速篩查的需求[11]、[12]。基于這一需求，亟需開發靈敏度高、快速且操作簡便的微小RNA檢測方法，以支持疾病早期篩查、即時診斷和精準醫療。為此，基于電信號輸出和現場操作能力的檢測策略應運而生，成為該領域的發展方向。
近年來，微通道因其尺寸可控、界面可修飾性強以及電化學響應特性優良，成為微小RNA檢測的有前景的平臺[13]、[14]、[15]。微通道內壁提供了較大的比表面積，有利于探針分子的高密度固定，提高了目標識別的效率[16]、[17]。此外，微通道對其內表面電荷的變化非常敏感，其導電性可以通過表面功能基團、離子環境和分子識別事件進行調節。這些變化可以直接轉化為可測量的電信號，如離子電流整流或電阻變化，體現了其在電信號轉導方面的優異性能[18]、[19]。此外，該平臺易于與便攜式電信號輸出設備（如萬用表）接口[20]，為開發簡單、快速、低成本的即時檢測系統提供了有力支持。例如，Feng等人開發了一種基于二氧化硅納米線-DNA納米探針功能化玻璃微通道（SiNWs-DNA@GMC）的自下而上組裝傳感器，實現了超低檢測限（6.61 × 10^-2拷貝/μL），并在9分鐘內完成電化學讀數，顯示出其在臨床病毒檢測中的巨大潛力[21]。Xu等人構建了一種氨基酸功能化的UiO-66門控納米通道，利用離子電流整流（ICR）特性在10 nM至10 mM的寬濃度范圍內檢測Co^2+離子，不僅提供了一種新的Co^2+檢測平臺，還揭示了Co^2+在納米通道內的傳輸機制[22]。Huang等人開發了一種基于微通道的生物傳感平臺，結合CRISPR-Cas12a系統的高特異性和萬用表讀數功能，實現了對p53基因的超靈敏檢測，檢測范圍為50 fM至50 pM，檢測限低至15 fM，為疾病相關DNA目標的即時檢測提供了有力工具[23]。這些研究共同證明了生物分子信號有效轉化為可檢測的電信號，為設計新一代高靈敏度、便攜式生物傳感器奠定了基礎。
在各種生物識別工具中，CRISPR-Cas系統因其極高的特異性和高效的切割活性而在分子診斷中展現出顯著潛力[24]、[25]、[26]、[27]。當CRISPR-Cas13a/crRNA復合物識別目標RNA時，會激活其非特異性RNase活性，無差別地切割報告基因RNA，從而成為構建高靈敏度生物傳感器的有效信號放大機制[28]、[29]、[30]、[31]。基于微通道的電阻傳感技術結合萬用表讀數方法最近受到關注[19]。本研究設計了一種簡單、快速、低成本的微通道電阻傳感器，用于檢測微小RNA-21（作為模型目標）。該方法將CRISPR/Cas13a的切割活性與微通道電阻傳感結合，利用數字萬用表實現定量讀數。微通道既作為核心傳感元件，也作為生物分子反應的場所，能夠實時監測電阻變化，萬用表作為讀數設備。微通道內壁修飾有帶負電荷的發夾DNA探針，只有在目標微小RNA-21激活后才會被Cas13a/crRNA復合物切割。這種切割引起的表面電荷變化直接轉化為可測量的電阻變化，進而改變微通道內的電解質離子富集和傳輸，導致電阻顯著增加或導電性降低。因此，切割前后的電阻變化（ΔR）為微小RNA檢測提供了靈敏的電信號。我們的方法具有操作簡便、靈敏度高、檢測速度快和系統集成性強等優點，為快速電生物標志物檢測提供了一種創新方法。
試劑和設備
- 3.
氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、氯化鉀（KCl）和無水乙醇由Macklin（中國上海）提供。TE緩沖液（1×溶液，低EDTA，pH 8.0）和經DEPC處理的水由Sangon（中國上海）提供。LawCas13a核酸酶（Cas13a）和10×Cas13a反應緩沖液來自Novoprotein Scientific Inc（中國上海）。本研究中使用的所有溶液均使用超純水（Milli-Q，Millipore，美國）配制。
DNA
使用萬用表作為讀數的便攜式微小RNA-21生物傳感器原理
本研究提出了一種基于CRISPR/Cas13a-微通道電阻傳感器的微小RNA檢測方法（以微小RNA-21為例進行驗證），采用萬用表作為讀數設備。如圖1a所示，建立了功能性的閉合電化學電路。反應室和傳感通道共享相同的電解質，一個Ag/AgCl電極位于反應室，另一個位于微通道中，兩者均連接到萬用表。
結論
本研究成功開發了一種基于CRISPR/Cas13a系統的便攜式微通道生物傳感器，用于微小RNA-21的檢測，并在血清樣本中驗證了其應用效果，顯示出滿意的靈敏度、選擇性和可靠性。目標微小RNA-21激活了Cas13a的切割活性，隨后Cas13a非特異性地切割固定在微通道內壁的發夾DNA探針中的“rUrU”序列。
作者貢獻聲明
Jiexin Wu：撰寫初稿、實驗研究、數據分析。Xiaoli Huang：實驗研究、數據分析。Huabin Cai：數據可視化、數據分析。Yiwei Xu：數據分析。Xinjia Wang：數據可視化、監督指導。Cuiying Lin：撰寫、審稿與編輯、監督指導、概念構思。Fang Luo：資源協調。Zhenyu Lin：撰寫、審稿與編輯、監督指導、方法學設計、資金申請。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本項目部分得到了國家自然科學基金（編號22374024）、廣東省基礎與應用基礎研究基金（編號2023B1515230004）以及福建省科技創新聯合基金（編號2023Y9088）的支持。
Jiexin Wu是福州大學化學學院的碩士研究生，她的研究方向是生物傳感器的開發與應用。
