中國是全球最大的養殖鰻魚生產國，約占全球產量的70%（Chen等人，2024a）。主要養殖的鰻魚種類包括日本鰻魚（Anguilla japonica）、歐洲鰻魚（Anguilla anguilla）和美洲鰻魚（Anguilla rostrata）（Parchemin等人，2022）。然而，這種集約化的養殖方式為傳染病的出現和傳播創造了有利條件。自20世紀90年代以來，一種稱為“粘液脫落和出血性敗血癥”的嚴重疾病頻繁影響中國的鰻魚養殖場，導致養殖戶遭受重大經濟損失（Ueno等人，1996）。臨床上，這種疾病表現為過度粘液分泌、皮膚潰瘍、皮下出血、頭部水腫、鰓壞死和全身性出血性敗血癥。鰻魚皰疹病毒1型（AngHV）是從受感染的鰻魚中分離出來的（Ge等人，2014），隨后被確定為該疾病的病原體（Chen等人，2021a）。

AngHV是養殖淡水鰻魚中廣泛存在的病原體，首次從養殖的日本鰻魚中分離出來是在1990年（Sano等人，1990）。自首次鑒定以來，AngHV已在包括中國（Ge等人，2014）、韓國（Kim等人，2024）、波蘭（Nguyen等人，2017）、越南（Panicz等人，2021）和印度尼西亞（Romadhona等人，2025）在內的多個國家和地區被檢測到。AngHV屬于皰疹病毒目（Herpesvirales）、異皰疹病毒科（Alloherpesviridae）和Cyvirus屬（Zhang等人，2024c），并被國際病毒分類委員會（ICTV）重新命名為Cyvirus anguillidallo 1。結構上，AngHV具有多層結構，包括內核、二十面體衣殼、中間層膜以及來自宿主細胞膜的包膜（Sano等人，1990）。其基因組位于內核內，由大約248.5 kbp長的線性雙鏈DNA組成，編碼136個開放閱讀框（ORFs）（Chen等人，2021b）。值得注意的是，ORF95基因編碼AngHV病毒顆粒的主要包膜蛋白，并包含可用于診斷檢測和治療干預的保守序列（Chen等人，2021b）。

AngHV感染的臨床和病理特征表現出相當大的變異性，受宿主種類和環境條件的影響（Guo等人，2022；Kim等人，2024；Nguyen等人，2017；Panicz等人，2021；Romadhona等人，2025）。重要的是，AngHV可以在鰻魚群體中建立潛伏感染而不表現出明顯的臨床癥狀（Ruiz-de-Ybá?ez等人，2023）。這種無癥狀的潛伏狀態給診斷帶來了重大挑戰，特別是在檢測攜帶者中的低病毒載量時，因此迫切需要靈敏和高效的檢測技術來促進疾病預防和控制。目前，已經建立了幾種AngHV的檢測方法，如傳統的PCR（Rijsewijk等人，2005）、定量PCR（qPCR）（Li等人，2021）、重組酶輔助擴增（RAA）（Chen等人，2024b）、環介導等溫擴增（LAMP）（Chen等人，2024a）和間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）（Van-Nieuwstadt等人，2001）。然而，這些方法在野外應用存在局限性：傳統PCR需要高病毒載量的樣本并進行瓊脂糖凝膠電泳，qPCR需要復雜的儀器，而ELISA需要嚴格的實驗室條件。等溫核酸擴增技術，如LAMP和RAA，可以從極低拷貝數的樣本中檢測目標核酸，而無需復雜設備（Srivastava和Prasad，2023）。然而，LAMP需要較高的等溫溫度（通常為60–65°C），并且需要設計4–6對特異性引物，增加了非特異性擴增的風險，可能導致假陽性結果（Crego-Vicente等人，2024）。同樣，RAA也需要精確的引物設計以減少非特異性擴增。因此，RAA和LAMP的擴增特異性高度依賴于引物，擴增產物通常需要通過整合其他策略進一步驗證。

將規律間隔短回文重復序列（CRISPR）相關蛋白12a（Cas12a）系統與等溫擴增技術相結合，成為一種通過同時目標擴增和信號增強實現快速核酸檢測的有前景的方法（Srivastava和Prasad，2023）。CRISPR-Cas12a系統在序列特異性核酸識別和切割方面表現出顯著的能力。在該系統中，crRNA引導Cas12a針對具有T富集的前間隔序列（PAM）（TTTV）的雙鏈DNA目標（Ding等人，2025）。結合后，Cas12a表現出順式切割和反式切割活性，后者能夠切割周圍的單鏈DNA（ssDNA）（Xiao等人，2025）。熒光染料和淬滅劑標記的ssDNA報告基因用于在切割時產生可檢測的熒光信號，可以使用熒光檢測儀器進行檢測（Leung等人，2022）。或者，用生物素標記的ssDNA報告基因可以通過側向流動條（LFS）進行檢測（Mak等人，2016）。然而，CRISPR/Cas12a系統的一個關鍵限制是其在沒有預先核酸擴增的情況下對低豐度目標的檢測靈敏度不足（Zhang等人，2024a）。通過將等溫擴增與CRISPR/Cas12a檢測系統結合可以解決這一限制。重組酶聚合酶擴增（RPA）屬于等溫擴增技術，適用于此目的，因為它可以在溫和溫度（37–42°C）下在10–25分鐘內高效擴增目標序列（Huang等人，2023）。RPA-CRISPR/Cas12a平臺結合了RPA的高靈敏度和CRISPR/Cas12a的嚴格特異性，有效消除了由非特異性擴增引起的假陽性信號。這種互補方法使得診斷系統既具有高靈敏度又具有嚴格特異性。目前，RPA-CRISPR/Cas12a平臺作為一種強大的診斷工具迅速發展起來，已成功應用于多種病原體的檢測，例如細菌病原體（如Vibrio harveyi、Pseudomonas plecoglossicida）（Zhong等人，2025；Jiang等人，2025）、病毒（如大黃魚虹彩病毒、白斑綜合征病毒和羅非魚湖病毒）（Zhang等人，2024b；Wang等人，2023；Sukonta等人，2022）和寄生蟲（如Clonorchis sinensis）（Huang等人，2023），展示了其在水生疾病監測中的多功能性。

在這項研究中，我們開發了一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的診斷平臺，用于AngHV的可視化檢測，并評估了其靈敏度、特異性、重復性和在臨床環境中的適用性。該平臺提供了兩種互補的讀數模式：（1）在藍光/紫外光下可視化熒光信號，用于實驗室確認；（2）LFS檢測，無需設備即可進行現場應用。總體而言，這項研究提供了一種快速、靈敏和可靠的AngHV現場檢測方法，具有顯著提升鰻魚養殖疾病預防和控制的潛力。