《Plant Physiology and Biochemistry》：CRISPR mediated inactivation of
OsPLDβ1 phospholipase enhances drought tolerance by upregulating stress-related genes and antioxidant enzymes in rice
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本研究針對水稻抗旱性提升的迫切需求，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了OsPLDβ1基因敲除的水稻突變體。研究發(fā)現(xiàn)，OsPLDβ1功能缺失能顯著增強(qiáng)水稻的干旱耐受性，其機(jī)制涉及活性氧（ROS）清除系統(tǒng)的增強(qiáng)、抗氧化酶活性的上調(diào)、水分利用效率的提高以及應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。該研究為通過分子育種培育抗旱水稻新品種提供了重要的基因靶點和理論依據(jù)。
隨著全球氣候變化加劇，干旱已成為制約水稻生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一。水稻作為全球半數(shù)以上人口的主糧，其生產(chǎn)穩(wěn)定性直接關(guān)系到糧食安全。植物在應(yīng)對干旱脅迫時，會激活一系列復(fù)雜的分子響應(yīng)機(jī)制，其中磷脂酶D（Phospholipase D, PLD）介導(dǎo)的脂質(zhì)信號通路在感知和傳導(dǎo)脅迫信號中扮演著關(guān)鍵角色。PLD能夠水解膜磷脂產(chǎn)生磷脂酸（Phosphatidic Acid, PA），后者作為重要的第二信使，參與調(diào)控植物的應(yīng)激反應(yīng)。水稻基因組中含有多個PLD家族成員，它們的功能存在冗余性和特異性，其中OsPLDβ1的功能尤其在干旱應(yīng)激響應(yīng)中尚不清晰。明確OsPLDβ1在水稻抗旱機(jī)制中的作用，對于理解植物耐旱機(jī)理及作物遺傳改良具有重要意義。相關(guān)研究成果發(fā)表在《Plant Physiology and Biochemistry》上。
為解析OsPLDβ1的功能，研究人員采用了CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，在秈稻品種Samba Mahsuri（BPT 5204）中成功獲得了OsPLDβ1基因功能缺失的純合突變體（Ospldβ1-1和Ospldβ1-2）。通過PCR和測序驗證了突變體的基因型。在生理水平上，研究通過盆栽干旱處理、離體葉片失水率測定、植株整體蒸騰速率測量、葉綠素含量測定、電解質(zhì)泄漏率分析、丙二醛（MDA）含量檢測以及抗氧化酶活性測定等一系列實驗，系統(tǒng)評估了突變體的抗旱表型。在分子機(jī)制層面，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析了干旱脅迫下應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)模式，并通過組織化學(xué)染色（DAB和NBT染色）觀察了活性氧的積累情況。
3.1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的OsPLDβ1基因突變
研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯OsPLDβ1基因的第一個外顯子，獲得了兩個獨立的純合突變體株系（Ospldβ1-1和Ospldβ1-2）。測序結(jié)果顯示，Ospldβ1-1發(fā)生了1個堿基（C）的插入，而Ospldβ1-2發(fā)生了1個堿基（C）的缺失，這兩種突變均導(dǎo)致閱讀框移位并產(chǎn)生提前終止密碼子，從而成功敲除了OsPLDβ1的功能。qRT-PCR分析證實，突變體中OsPLDβ1的轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低。
3.2. OsPLDβ1敲除提高抗旱性及細(xì)胞膜穩(wěn)定性
在干旱脅迫下，Ospldβ1突變體相比野生型（WT）表現(xiàn)出更強(qiáng)的存活率（89-93% vs 6%）。突變體的葉片相對含水量（RWC）更高，電解質(zhì)泄漏率和MDA含量更低，表明其細(xì)胞膜受損程度更輕。同時，突變體在干旱下能保持更高的葉綠素含量。
3.3. 通過離體葉片和整株植物蒸騰分析評估水分狀況
離體葉片失水實驗表明，Ospldβ1突變體的失水速率顯著低于WT。整株植物蒸騰測量進(jìn)一步證實，突變體在日常蒸騰中水分損失減少10.4%至13.9%。紅外熱成像顯示，在干旱條件下，突變體的冠層溫度低于WT，表明其通過蒸騰冷卻保持了較好的水分狀態(tài)。
3.4. OsPLDβ1負(fù)調(diào)控干旱脅迫下的活性氧清除系統(tǒng)
DAB和NBT組織化學(xué)染色顯示，干旱脅迫下Ospldβ1突變體中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2.-）的積累顯著少于WT。生化測定發(fā)現(xiàn)，突變體中超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化氫酶（CAT）的活性更高，與其相關(guān)基因（如OsAPX8, OsCAT-a）的上調(diào)表達(dá)一致。
3.5. OsPLDβ1敲除顯著改善營養(yǎng)生長階段的滲透脅迫耐受性
在甘露醇模擬的滲透脅迫下，Ospldβ1突變體在種子萌發(fā)和幼苗生長階段均表現(xiàn)出比WT更強(qiáng)的耐受性。突變體的主根更長，根數(shù)更多，存活率更高，且電解質(zhì)泄漏率更低。根部組織化學(xué)染色也顯示突變體ROS積累更少。
3.6. OsPLDβ1功能缺失增強(qiáng)對甲基紫精誘導(dǎo)的光氧化損傷的耐受性
用甲基紫精（Methyl Viologen, MV）處理離體葉片誘導(dǎo)光氧化脅迫后，Ospldβ1突變體的葉綠素降解程度顯著低于WT，且H2O2和O2.-積累更少，表明其抗氧化損傷能力更強(qiáng)。
3.7. OsPLDβ1功能缺失增加水稻對外源ABA的敏感性
在含有外源脫落酸（ABA）的培養(yǎng)基上，Ospldβ1突變體種子的萌發(fā)率、幼苗鮮重、根長和苗高均受到比WT更顯著的抑制，表明突變體對ABA的敏感性增加。這提示OsPLDβ1可能負(fù)調(diào)控ABA信號通路。
3.8. 水稻中PLDβ1功能缺失調(diào)節(jié)應(yīng)激響應(yīng)基因和其他PLD亞型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在Ospldβ1突變體中，其他PLD家族成員（如OsPLDα1, OsPLDα3, OsPLDδ1, OsPLDδ2, OsPLDδ3）以及多種應(yīng)激響應(yīng)基因（如bZIP68, ONAC7, TPP1, LEA7, OsNCED1, OsNCED2, CCR10, Dirigent, P5CS, DREB1A, OsAPX8, OsCAT-a）的表達(dá)水平在干旱脅迫下均顯著上調(diào)。這表明OsPLDβ1的缺失可能激活了一個更廣泛的應(yīng)激防御網(wǎng)絡(luò)。
本研究通過多角度證據(jù)表明，敲除OsPLDβ1能通過多種機(jī)制顯著增強(qiáng)水稻的抗旱性。在生理層面，突變體通過降低蒸騰速率、提高水分利用效率、維持細(xì)胞膜完整性和葉綠素含量來減少干旱造成的損傷。在生化層面，突變體增強(qiáng)了抗氧化酶系統(tǒng)的活性，有效清除了干旱誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量ROS，減輕了氧化損傷。在分子層面，OsPLDβ1的缺失可能解除了其對其他PLD亞型（如PLDα1, PLDδ等）或相關(guān)應(yīng)激通路的抑制作用，導(dǎo)致PA信號或其他保護(hù)性信號增強(qiáng)，并最終引發(fā)一系列應(yīng)激保護(hù)基因（包括抗氧化、滲透調(diào)節(jié)、ABA合成、木質(zhì)素合成等相關(guān)基因）的上調(diào)表達(dá)，從而形成了更強(qiáng)大的綜合防御體系。特別值得注意的是，突變體對ABA的敏感性增加，暗示OsPLDβ1可能作為一個負(fù)調(diào)控因子參與ABA信號通路，其缺失使得ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和應(yīng)激響應(yīng)更為迅速有效。該研究不僅首次明確了OsPLDβ1在水稻抗旱中的負(fù)向調(diào)控作用，為理解PLD家族各成員功能的復(fù)雜性和特異性提供了新視角，而且為利用基因編輯技術(shù)定向改良水稻抗旱性提供了有應(yīng)用前景的基因靶點（OsPLDβ1），對于培育節(jié)水抗旱的水稻新品種、應(yīng)對全球氣候變化下的糧食安全挑戰(zhàn)具有重要的理論和實踐意義。
