《Sensors and Actuators B: Chemical》：Highly Sensitive Detection of Epithelial Markers on Single Tumor Cell Surface by an Endonuclease-assisted Assay on Superwettable Droplet Microarrays (EASDM)
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CRISPR/Cas12a結合新型G4熒光探針實現低成本高靈敏度分子檢測，通過3'端尾序列穩定G4結構并增強切割效率，釋放熒光信號，并建立RPA輔助檢測體系，靈敏度達16 aM，特異性為單堿基，驗證了HBV檢測100%與qPCR一致性。
黃娟 | 吳文文 | 陸世月 | 徐媛 | 張紅 | 上書 | 楊欣 | 何洪飛 | 王強 | 楊漢鋒 | 羅廣城
四川省北川醫學院附屬醫院臨床實驗室；四川省北川醫學院實驗室醫學與轉化醫學研究中心，中國南充637000
摘要
將CRISPR/Cas12a與成本效益高的探針結合使用對于分子診斷至關重要。然而，經典的熒光團-淬滅劑標記的單鏈DNA（ssDNA）探針具有較高的生產成本。在此，我們開發了一種新型的無淬滅劑熒光G-四鏈體（G4）探針，適用于CRISPR/Cas12a，具有出色的成本效益。我們發現FAM熒光團可以被G4有效淬滅，而將3′側翼序列引入單個FAM標記的G4中會破壞其拓撲結構，從而實現CRISPR/Cas12a的有效切割，釋放出被G4淬滅的熒光。與傳統關閉型CRISPR/Cas12a/G4系統相比，這種G4輔助CRISPR/Cas12a報告系統（GCR）創新性地實現了成本效益高的開啟型信號輸出。此外，我們將GCR與先前開發的dNTPαS輔助的RPA結合，建立了RPA/GCR檢測方法。該方法具有超靈敏度（高達16 aM）和單堿基分辨能力，HBV DNA檢測結果與qPCR結果完全一致（100%一致）。總之，我們開發了一種新型的CRISPR/Cas12a/G4開啟型信號輸出策略，并建立了一種實用的RPA/GCR檢測方法，凸顯了其在分子診斷中的巨大潛力。
引言
分子診斷在傳染病、遺傳疾病和惡性腫瘤[1]、[2]、[3]中發揮著重要作用。作為新興的尖端分子診斷工具，CRISPR/Cas系統受到了廣泛關注并得到了廣泛應用[4]、[5]。對于核酸檢測，CRISPR/Cas12a可以特異性識別目標DNA并高效非特異性地降解單鏈DNA（ssDNA），從而將目標DNA識別轉化為可檢測的信號[5]、[6]、[7]。
基于切割機制，CRISPR/Cas12a通常使用FAM/BHQ雙標記的ssDNA來實現開啟型信號輸出（ssDNA降解后釋放被淬滅的熒光）[8]、[9]，或使用G4實現關閉型比色檢測（G4降解后消除G4過氧化物酶活性和顯色反應）[10]、[11]、[12]。然而，相對昂貴的FAM/BHQ雙標記報告系統在儲存過程中不穩定，導致淬滅效率降低[13]。G4通過方形Hoogsteen氫鍵網絡形成堆疊的G-四鏈結構。將G4整合到CRISPR/Cas12a中是一種成本效益高的比色核酸檢測方法[14]、[15]。然而，這些方法通常呈現關閉型讀數模式[16]、[17]。因此，迫切需要開發低成本、簡單且可視化的CRISPR/Cas12a基核酸檢測報告系統。
研究表明，核酸堿基具有熒光淬滅效應，其中鳥嘌呤（G）的淬滅效率最高[18]、[19]。G4豐富的獨特結構使我們推測它們可以有效淬滅熒光。然而，G4自身的核酸酶抗性對CRISPR/Cas12a介導的切割有顯著影響，從而不利于信號生成[20]、[21]、[22]。先前的研究表明，G4的穩定性會隨著環或側翼序列長度的增加而降低[23]。基于這些發現，我們假設向G4中添加側翼序列可以通過破壞G4結構來提高CRISPR/Cas12a的切割效率。
在此，我們開發了一種新型的G4輔助CRISPR/Cas12a報告系統（GCR），該系統將CRISPR/Cas12a與3′端帶有G4的探針結合以實現信號輸出。與傳統關閉型CRISPR/Cas12a/G4系統[16]、[17]不同，我們的GCR創新性地實現了成本效益高的開啟型信號輸出。此外，利用先前開發的S-RPA（dNTPαS輔助的RPA）[24]，我們成功建立了RPA/GCR檢測方法。該方法具有超靈敏度（高達16 aM）、高特異性（能夠區分單堿基），并且實際應用效果良好（與qPCR結果一致率100%），展示了其在分子診斷中的巨大潛力。
材料與試劑
試劑包括DNA寡核苷酸、質粒、gRNA、dNTPs、SYBR Green、丙烯酰胺/甲基丙烯酰胺（29:1）、聚丙烯酰胺、丙烯酰胺/雙丙烯酰胺溶液、4SGelred核酸染料以及6×、2× DNA上樣緩沖液，均購自上海Sangon Biotech（中國上海）。3'-FAM修飾的DNA寡核苷酸購自Hippo Biotechnology（中國浙江）。磷硫酰修飾的dNTPs（dNTPαS）購自Zhong Meng Research Technology（湖北）。
Cas12a對帶尾G4的高效切割
根據我們的假設（圖1A），線性Poly G和G4能有效淬滅熒光（圖S1），但抵抗Cas12a的切割；而帶有3′側翼序列的3′-尾G4既能淬滅熒光又能被Cas12a有效切割。實時分析證實，3′-尾G4（尤其是G42-1）的Cas12a切割效率更高（圖1B），且熒光差異最顯著（圖1C），優于線性Poly G和常規G4。PAGE分析顯示（
討論
CRISPR/Cas12a和G4的組合是比色核酸檢測中最常見的策略之一。然而，這種策略通常依賴于CRISPR/Cas12a介導的G4切割來產生關閉型信號輸出[16]、[17]。研究表明鳥嘌呤（G）可以有效淬滅熒光[18]、[19]。因此，我們推測富含G的G4可以無需額外淬滅基團即可有效淬滅FAM熒光；Cas12a介導的G4
資助
本工作得到了以下資助：國家自然科學基金（82472386）、四川省自然科學基金（2024NSFSC1546）、四川省衛生健康委員會（23LCYJ038）、南充市科技基金（23JCYJPT0032）、四川省北川醫學院附屬醫院研究基金（2024CX001和2023PTZK016）。
CRediT作者貢獻聲明
楊欣：驗證、方法學設計。上書：研究實施、資金籌集。張紅：項目管理、資金籌集。徐媛：研究實施、資金籌集。陸世月：數據可視化、驗證。吳文文：研究實施、數據分析。黃娟：初稿撰寫、驗證、數據管理。羅廣城：撰寫、審稿與編輯、監督、資金籌集、概念構思。楊漢鋒：監督、軟件開發、資金籌集。黃娟于2025年獲得四川省北川醫學院臨床實驗室診斷碩士學位。她目前在中國綿陽市安州區人民醫院臨床實驗室擔任實驗室技術員，主要從事新型分子探針和分子診斷技術的研究。
