《Sensors and Actuators B: Chemical》：Novel G-quadruplex probe coupled with CRISPR/Cas12a for ultrasensitive and highly specific nucleic acid testing
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CRISPR/Cas12a與新型淬滅-free熒光G4探針結合實現高效核酸檢測，通過3'末尾序列調控G4穩定性增強切割效率，靈敏度達16 aM，與qPCR結果完全一致。
黃江|吳文文|盧世月|徐源|張紅|尚書|楊欣|何洪飛|王強|楊漢峰|羅光成
四川省北醫學院附屬醫院臨床實驗室；四川省北醫學院實驗室醫學與轉化醫學研究中心，中國南充637000
摘要
將CRISPR/Cas12a與成本效益高的探針結合對于分子診斷至關重要。然而，經典的熒光團-淬滅劑標記的單鏈DNA（ssDNA）探針具有較高的生產成本。在此，我們開發了一種新型的無淬滅劑熒光G四鏈體（G4）探針，具有出色的成本效益，適用于CRISPR/Cas12a。我們發現FAM熒光團可以被G4有效淬滅，而在單個FAM標記的G4中引入3′端側翼序列會破壞其拓撲結構，從而使得CRISPR/Cas12a能夠高效地進行切割并釋放被G4淬滅的熒光。與傳統關閉型CRISPR/Cas12a/G4系統相比，這種G4輔助的CRISPR/Cas12a報告系統（GCR）創新性地實現了成本效益高的開啟型信號輸出。此外，我們將GCR與先前開發的dNTPαS輔助的RPA技術整合，建立了RPA/GCR檢測方法。該方法具有超靈敏度（高達16 aM）和單堿基分辨能力，HBV DNA檢測結果與qPCR結果的一致性達到100%。總之，我們開發了一種新型的CRISPR/Cas12a/G4信號開啟策略，并建立了一種實用的RPA/GCR檢測方法，展示了其在分子診斷中的巨大潛力。
引言
分子診斷在傳染病、遺傳病和惡性腫瘤的檢測中發揮著重要作用[1]、[2]、[3]。作為新興的尖端分子診斷工具，CRISPR/Cas系統受到了廣泛關注并得到了廣泛應用[4]、[5]。對于核酸檢測，CRISPR/Cas12a能夠特異性識別目標DNA并高效地非特異性降解單鏈DNA（ssDNA），從而將目標DNA的識別轉化為可檢測的信號[5]、[6]、[7]。
基于這種切割機制，CRISPR/Cas12a通常使用FAM/BHQ雙標記的ssDNA來實現開啟型信號輸出（ssDNA降解后釋放被淬滅的熒光）[8]、[9]，或使用G4實現關閉型比色檢測（G4降解后消除G4過氧化物酶活性和顯色反應）[10]、[11]、[12]。然而，相對昂貴的FAM/BHQ雙標記報告系統在儲存過程中不穩定，導致淬滅效率降低[13]。G4是通過四方Hoogsteen氫鍵網絡形成的G四鏈結構。將G4整合到CRISPR/Cas12a中是一種成本效益高的比色核酸檢測方法[14]、[15]。然而，這些方法通常采用關閉型讀出模式[16]、[17]。因此，迫切需要開發低成本、簡單且可視化的CRISPR/Cas12a核酸檢測報告系統。
研究表明，核酸堿基具有熒光淬滅效應，其中鳥嘌呤（G）的淬滅效率最高[18]、[19]。G4豐富的獨特結構使我們推測它們能夠有效淬滅熒光。然而，G4本身的核酸酶抗性對CRISPR/Cas12a介導的切割過程有顯著影響，從而不利地影響了信號生成[20]、[21]、[22]。先前的研究顯示，隨著環狀結構或側翼序列長度的增加，G4的穩定性會降低[23]。基于這些發現，我們推測在G4中添加側翼序列可以通過破壞其結構來提高CRISPR/Cas12a的切割效率。
在此，我們開發了一種新型的G4輔助的CRISPR/Cas12a報告系統（GCR），通過將CRISPR/Cas12a與3′端帶側翼序列的G4結合來實現信號輸出。與傳統關閉型CRISPR/Cas12a/G4系統[16]、[17]不同，我們的GCR創新性地實現了成本效益高的開啟型信號輸出。此外，利用先前開發的S-RPA（dNTPαS輔助的RPA）[24]，我們成功建立了RPA/GCR檢測方法。該方法具有超靈敏度（高達16 aM）、高特異性（能夠區分單堿基），并且與qPCR結果的一致性達到100%，展示了其在分子診斷中的巨大潛力。
材料與試劑
試劑包括DNA寡核苷酸、質粒、gRNA、dNTPs、SYBR Green、丙烯酰胺/甲基丙烯酰胺（29:1）、聚丙烯酰胺、丙烯酰胺/雙丙烯酰胺溶液、4SGelred核酸染料以及6×、2× DNA上樣緩沖液，均購自上海Sangon Biotech（中國上海）。3'-FAM修飾的DNA寡核苷酸購自Hippo Biotechnology（中國浙江）。磷酸硫代酯修飾的dNTPs（dNTPαS）購自Zhong Meng Research Technology（湖北）。
Cas12a對帶尾G4的高效切割
根據我們的假設（圖1A），線性Poly G和G4能夠有效淬滅熒光（圖S1），但抵抗Cas12a的切割；而帶有3′端側翼序列的3′-尾G4既能淬滅熒光又能被Cas12a高效切割。實時分析證實，3′-尾G4（特別是G42-1）具有更高的Cas12a切割效率（圖1B）和最顯著的熒光差異（圖1C），優于線性Poly G和常規G4。PAGE分析進一步驗證了這一結果。
討論
CRISPR/Cas12a與G4的結合是比色核酸檢測中最常見的策略之一。然而，這種策略通常依賴于CRISPR/Cas12a介導的G4切割來產生關閉型信號[16]、[17]。研究表明鳥嘌呤（G）能夠有效淬滅熒光[18]、[19]。因此，我們推測富含G的G4可以無需額外淬滅基團即可有效淬滅FAM熒光；Cas12a介導的G4切割過程可以進一步增強這種效果。
資助
本工作得到了以下資助：國家自然科學基金（82472386）、四川省自然科學基金（2024NSFSC1546）、四川省衛生健康委員會（23LCYJ038）、南充市科學技術基金（23JCYJPT0032）以及四川省北醫學院附屬醫院研究基金（2024CX001和2023PTZK016）的支持。
CRediT作者貢獻聲明
楊欣：驗證、方法學研究。尚書：研究工作、資金獲取。張紅：項目管理、資金獲取。徐源：研究工作、資金獲取。盧世月：數據可視化、驗證。吳文文：研究工作、數據分析。黃江：初稿撰寫、驗證、數據管理。羅光成：撰寫、審稿與編輯、監督、資金獲取、概念設計。楊漢峰：監督、軟件開發、資金獲取。
黃江于2025年獲得四川省北醫學院臨床實驗室診斷碩士學位。目前她在中國綿陽市安州區人民醫院臨床實驗室擔任技術員，主要從事新型分子探針和分子診斷技術的研發工作。
