CRISPR/Cas（規(guī)律間隔短回文重復序列相關(guān)Cas蛋白）系統(tǒng)是細菌和古菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[1]，[2]，用于抵御噬菌體和質(zhì)粒等外源遺傳物質(zhì)的入侵。它是一種強大的基因編輯技術(shù)，在生物醫(yī)學、農(nóng)業(yè)和工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[3]，[4]。CRISPR/Cas12a（Cpf1）是CRISPR-Cas系統(tǒng)的一個成員，屬于II類V型CRISPR-Cas系統(tǒng)[5]，[6]，[7]。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)可以通過識別目標雙鏈DNA（dsDNA）或單鏈DNA（ssDNA）被激活，激活的Cas12a可以對周圍的ssDNA進行非特異性轉(zhuǎn)剪切[8]，[9]，[10]，[11]。基于這一特性，它非常適用于核酸檢測。脫氧核糖核酸（DNA）可以直接被CRISPR/Cas12a識別和檢測，而對于類似miRNA的目標分子，則需要先進行逆轉(zhuǎn)錄成DNA，但這種檢測方法通常不夠靈敏，且需要核酸擴增，例如重組酶聚合酶擴增（RPA）[12]、鏈替換擴增[13]、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）[14]、滾環(huán)擴增（RCA）[15]和環(huán)介導等溫擴增（LAMP）[16]。然而，由于CRISPR/Cas12a一旦被激活，會無差別地剪切周圍的ssDNA，這可能導致核酸擴增模板降解，從而降低擴增效果[17]。因此，CRISPR/Cas12a的激活和核酸擴增不能同時進行，通常需要分階段添加或逐步反應(yīng)來完成，這會增加污染風險并延長反應(yīng)時間。

為了解決上述問題，研究人員嘗試通過控制crRNA的釋放來調(diào)節(jié)Cas12a的活性，以減少CRISPR/Cas的背景泄漏并實現(xiàn)一步檢測。例如，修改crRNA鏈中的光不穩(wěn)定基團[18]，或使用與crRNA雜交的寡核苷酸鏈來阻斷crRNA的識別[19]，[20]，[21]。這一過程需要優(yōu)化crRNA上光不穩(wěn)定基團的位置以及寡核苷酸鏈與crRNA的比例；不當?shù)奈恢煤捅壤龝�影響閉合效果。另一種策略是通過調(diào)整crRNA的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)crRNA與Cas12a的結(jié)合活性。通過延長crRNA的5'端或3'端來閉合crRNA，從而抑制Cas12a的活性[22]，[23]，[24]，并通過目標分子釋放crRNA作為開關(guān)來激活Cas12a以實現(xiàn)信號釋放。但使用延長的RNA會導致復雜的二級結(jié)構(gòu)形成和較高的合成成本。因此，迫切需要一種更簡單、更通用的激活劑閉合方式，能夠在目標暴露后迅速恢復CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的功能，而無需對crRNA結(jié)構(gòu)進行復雜和嚴格的修飾。

最近，羅某和耿某等人發(fā)現(xiàn)分裂DNA激活劑可以表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)[25]，[26]，[27]，通過分裂DNA的協(xié)同作用激活Cas12a的轉(zhuǎn)剪切活性，從而實現(xiàn)高信號釋放�？啄车难芯啃〗M發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas12a的“RESET”效應(yīng)，即當激活鏈形成完整的發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，會抑制其激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的能力[28]，[29]�；�于此，在本文中，我們設(shè)計了隱藏在兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖部的分裂CRISPR/Cas12a系統(tǒng)激活劑，目標miRNA的堿基互補配對使發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，從而暴露出一半的激活鏈。另一半激活鏈通過APE1（Apurinic/apyrimidinnic內(nèi)切酶1）的剪切作用被釋放，釋放出的兩條分裂激活鏈可以特異性結(jié)合crRNA形成完整的激活鏈并激活CRISPR/Cas12a，從而快速實現(xiàn)信號釋放。這種多刺激響應(yīng)和分裂激活的CRISPR/Cas系統(tǒng)為精準診斷和成像研究領(lǐng)域的基因編輯系統(tǒng)提供了新的范例。