鵝細小病毒（GPV）感染，也稱為德氏病，是一種主要影響雛鵝和鴨子的傳染性病毒疾病。該病的癥狀包括嗜睡、嚴重的水樣腹瀉、生長遲緩、羽毛脫落和腸道栓塞，五天以下的雛鵝死亡率超過95% [1]。該疾病已在中國、歐洲和美國被記錄到，對水禽養殖構成了嚴重威脅 [2]。近年來，一種新的GPV株的出現進一步復雜化了疾病管理。這種變異株會導致櫻桃谷鴨和麝香鴨的生長受阻，加劇了控制GPV疫情的難度 [3]、[4]。鑒于GPV造成的經濟損失和高死亡率，開發準確、快速和高效的診斷方法對于實施有效的預防和控制策略至關重要。

GPV感染的診斷與其他病毒性疾病類似，通常首先通過評估臨床癥狀和流行病學調查開始，然后通過血清學或分子方法（如聚合酶鏈反應（PCR）進行實驗室確認 [5]。常用的血清學技術包括瓊脂凝膠免疫擴散、病毒中和試驗和酶聯免疫吸附試驗；然而，這些方法的應用往往受到操作復雜性和專業人才需求的限制 [6]、[7]。分子方法（如PCR）具有更高的特異性和敏感性。例如，Wan等人 [8] 開發了一種針對NS基因的PCR檢測方法，能夠檢測到低至10^3拷貝的GPV。同樣，Lin等人 [9] 設計了一種基于SYBR Green的定量PCR（qPCR）方法，可檢測到10^1拷貝的GPV。盡管這些方法精度較高，但傳統的PCR和qPCR都需要昂貴的熱循環設備和專業技術知識，這限制了它們在現場診斷中的實用性，尤其是在資源有限的環境中。

COVID-19的爆發加速了快速、便攜式診斷技術的發展，如重組酶聚合酶擴增（RPA）和環介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification），這些技術對于疫情預防和控制至關重要。與傳統PCR方法相比，這些等溫擴增技術具有反應時間短、設備要求低和更適合現場應用等優點。例如，RPA可以在37°C的恒定溫度下在30分鐘內擴增目標核酸，從而簡化程序并顯著縮短檢測時間 [10]。當與逆轉錄酶結合使用時，RPA可以快速檢測RNA病毒（如拉克羅斯病毒），cDNA擴增可在20分鐘內完成 [11]。此外，RPA與SYBR Green染料的結合使得能夠在25分鐘內準確檢測牛病毒性腹瀉病毒，同時具有更高的速度和特異性，且不會與其他腹瀉病原體發生交叉反應 [12]。此外，RPA與CRISPR/Cas12a技術的結合推動了便攜式、可視化、現場診斷工具的發展 [13]、[14]。一個典型的例子是一種基于熒光的即時檢測（POC）系統，能夠在2小時內高通量檢測非洲豬瘟病毒（ASFV）[15]，展示了RPA-CRISPR/Cas12a系統在快速現場診斷方面的潛力。

在本研究中，我們開發了一種利用RPA結合CRISPR和Acidaminococcus sp. CRISPR-associated nuclease 12a（AsCas12a）的快速高靈敏度GPV檢測方法。與現有的RPA-CRISPR平臺相比，我們的研究在兩個方面進行了創新：首先，我們開發了一種基于側向流動分析的新方法，其靈敏度比傳統PCR提高了100倍，便于快速可靠的現場GPV診斷；其次，我們建立了一種高靈敏度的熒光檢測系統，使用較低濃度的AsCas12a，檢測限達到7.8拷貝/μL。該系統的靈敏度與Chen等人之前報道的GPV-CRISPR/Cas12a系統相當，同時檢測成本降低了約5倍。表S1詳細比較了我們的方法與Chen等人的方法，在檢測反應濃度、靈敏度、特異性和成本方面進行了說明。這些改進顯著提高了GPV檢測方法的靈敏度和現場適用性。

由于成本效益和已建立的可靠性，傳統的PCR仍然是實驗室環境中廣泛使用的GPV檢測方法。先前的研究（包括我們的實驗數據）表明，傳統PCR的檢測限為10^3拷貝/μL [8]、[17]（見表S1）。然而，這種靈敏度限制了PCR在早期GPV感染樣本中的診斷應用。

為了提高GPV檢測的靈敏度，我們采用了多種改進措施。