多站點(diǎn)Crelox重組技術(shù)有助于闡明調(diào)控機(jī)制，并實(shí)現(xiàn)對(duì)Aspergillus nidulans中棘孢菌素B生物合成的系統(tǒng)工程改造
《Metabolic Engineering》：Multisite Cre-
lox Recombination Enables Regulatory Mechanism Elucidation and Systematic Engineering of Echinocandin B Biosynthesis in
Aspergillus nidulans
編輯推薦：
真菌合成生物學(xué)、正交Cre-lox系統(tǒng)、代謝工程優(yōu)化、echinocandin B產(chǎn)量提升、多基因協(xié)同調(diào)控
Youchu Ma|Yue Zhang|Dongfang Zhang|Yue Tang|Wanyu Zhang|Liyuan Yue|Wenqing Lou|Chao Meng|Yanling Li|Xiulai Chen|Fanglong Zhao
山東第一醫(yī)科大學(xué)與山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)山東省泰安市，271016
摘要
棘球素B（ECB）是一種用于合成抗真菌藥物的環(huán)狀脂六肽，由Aspergillus nidulans中的非核糖體肽合成酶基因簇產(chǎn)生。然而，其工業(yè)生產(chǎn)仍受到生產(chǎn)效率低下的限制，主要是由于生物合成途徑的復(fù)雜性以及絲狀真菌中缺乏多基因調(diào)控工具。在此，我們建立了一個(gè)基于Cre-lox的正交平臺(tái)，能夠在A. nidulans中實(shí)現(xiàn)最多30 kb的單點(diǎn)插入和10 kb DNA片段的同步雙點(diǎn)整合。通過(guò)前體補(bǔ)充和目標(biāo)基因過(guò)表達(dá)，我們確定了前體生物合成途徑中的關(guān)鍵酶學(xué)瓶頸，包括氧合酶AniF、 AniK、AniG以及酰基-AMP連接酶AniI。這些基因的組合過(guò)表達(dá)協(xié)同作用提高了ECB的產(chǎn)量。此外，我們還通過(guò)過(guò)表達(dá)對(duì)反饋具有抗性的Hom3（L-蘇氨酸途徑）和LeuC（L-亮氨酸途徑）突變體來(lái)解決天然氨基酸生物合成中的瓶頸問(wèn)題。利用我們的多基因整合平臺(tái)重新調(diào)控這些關(guān)鍵基因的表達(dá)，我們?cè)?-L發(fā)酵罐中將ECB的產(chǎn)量提高了3.5 ± 0.2 g/L，這一改進(jìn)幅度是迄今為止文獻(xiàn)中報(bào)道的最高水平。我們的正交雙點(diǎn)整合策略和系統(tǒng)優(yōu)化方法為絲狀真菌中復(fù)雜天然產(chǎn)物的代謝工程提供了有價(jià)值的框架。
引言
真菌感染是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年影響超過(guò)十億人（Fisher等人，2022年）。棘球素類化合物（包括卡泊芬凈（Cancidas?，默克公司）、米卡芬凈（Mycamine?，安斯泰來(lái)公司）、阿尼杜拉芬凈（Eraxis?，輝瑞公司）和雷扎芬凈（Rezzayo?，Cidara Therapeutics公司）是侵襲性念珠菌病和曲霉病的一線治療藥物（Albanell-Fernández，2025年）。這些脂六肽作為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠抑制真菌的1,3-β-葡聚糖合成酶，從而破壞真菌細(xì)胞壁的生物合成（Hu等人，2023年）。作為該類藥物的最新成員，雷扎芬凈具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性和水溶性，半衰期延長(zhǎng)至約一周，簡(jiǎn)化了儲(chǔ)存和給藥方案（Garcia-Effron，2020年）。
棘球素B（ECB）由真菌的非核糖體肽合成酶（NRPS）生產(chǎn)，是阿尼杜拉芬凈和雷扎芬凈的關(guān)鍵前體（圖1A）。阿尼杜拉芬凈是一種半合成脂肽，通過(guò)用合成三苯基基團(tuán)替換其天然的亞油酸鏈獲得；而雷扎芬凈則通過(guò)在鳥(niǎo)氨酸殘基的C5位引入膽堿醚結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)一步提高溶解性和穩(wěn)定性（Szymański等人，2022年）。因此，高效的ECB生產(chǎn)對(duì)于這些抗真菌藥物的制造至關(guān)重要。然而，現(xiàn)有的發(fā)酵工藝產(chǎn)量低且產(chǎn)量不穩(wěn)定，限制了其大規(guī)模和低成本的生產(chǎn)（Emri等人，2013年；Hüttel，2021年；Jiang等人，2024年；Niu等人，2021年；Niu等人，2025年；Szymański等人，2022年；Tian等人，2024年）。
合成生物學(xué)方法有助于闡明生物合成過(guò)程并優(yōu)化代謝途徑，從而提高產(chǎn)量。在Aspergillus nidulans NRRL8112中，已經(jīng)鑒定并表征了ECB的生物合成基因簇（ani BGC）；該基因簇編碼13個(gè)基因，參與非蛋白質(zhì)氨基酸前體的合成、NRPS的組裝以及六肽的修飾。該途徑可以分為三個(gè)功能模塊（圖1C）（Cacho等人，2012年；Hüttel，2016年；Jiang等人，2013年；Jiang等人，2025年）：（1）NRPS組裝模塊，其中AniA（NRPS）和AniI（脂肪酰基AMP連接酶）利用活化的亞油酸、L-鳥(niǎo)氨酸、兩個(gè)L-蘇氨酸單元以及三種非典型氨基酸（4R-羥基-L-脯氨酸（OH-Pro）、3S-羥基-L-同型酪氨酸（OH-hTyr）和4S-甲基-3S-羥基-L-脯氨酸（OH-MePro）組裝六肽核心；（2）前體合成模塊，生成非蛋白質(zhì)氨基酸：OH-Pro通過(guò)鐵依賴性氧化酶AniF催化的羥基化反應(yīng)生成；OH-hTyr通過(guò)AniB到AniF的多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)將初級(jí)代謝中間體4-羥基苯丙酸（4-HPPA）依次轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-同型酪氨酸（hTyr），隨后在C3位進(jìn)行羥基化；同時(shí)，OH-MePro通過(guò)AniK和AniF的協(xié)同作用生成，這兩種酶分別催化L-亮氨酸的氧化和羥基化；（3）六肽修飾模塊，其中P450單加氧酶AniH和AniF2分別催化循環(huán)肽中L-Orn殘基的C4/C5位和hTyr殘基的C4位的羥基化。
復(fù)雜的ECB生物合成途徑受多種因素共同影響，這些因素共同決定了生產(chǎn)效率。六種前體底物的可用性、NRPS組裝的催化效率以及修飾酶的活性都直接影響最終產(chǎn)量。發(fā)酵研究表明，補(bǔ)充某些氨基酸前體可以顯著提高ECB的產(chǎn)量（Hu等人，2016年；Niu等人，2020年；Niu等人，2023年），表明前體供應(yīng)是一個(gè)關(guān)鍵瓶頸。環(huán)境參數(shù)（如溫度、離子強(qiáng)度和滲透壓）也會(huì)影響ECB的產(chǎn)量（Cockshott等人，2001年；Hu等人，2016年；Hu等人，2020年；Niu等人，2020年；Niu等人，2023年；Zou等人，2015年），其中溫度具有顯著影響。先前的研究表明，高溫（30-37 °C）會(huì)顯著下調(diào)ECB基因簇的表達(dá)（Jiang等人，2025年），通常建議在25 °C下進(jìn)行培養(yǎng)。高溫下是否會(huì)出現(xiàn)其他代謝限制尚不清楚。近年來(lái)，CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了ECB代謝調(diào)控機(jī)制的研究。特別是，發(fā)現(xiàn)了幾種全局調(diào)控因子（LaeA、VeA和VelB）（Lan等人，2020年）和途徑特異性調(diào)控因子（AniJ/EcdJ）（Jiang等人，2025年；Tian等人，2024年），為合理工程提供了新的靶點(diǎn)。然而，天然轉(zhuǎn)錄因子對(duì)生物合成基因的不同激活方式往往會(huì)導(dǎo)致代謝通量的不平衡。這些限制凸顯了系統(tǒng)化途徑工程的需求。
工程化復(fù)雜的生物合成途徑通常需要大規(guī)模的基因組重組，這需要大規(guī)模的基因組整合策略（Dong和Chen，2025年；Ko等人，2020年；Shi等人，2016年）。由于多種因素影響ECB的生物合成，同時(shí)進(jìn)行多基因位點(diǎn)的基因組整合將大大有助于揭示它們對(duì)生產(chǎn)效率的協(xié)同效應(yīng)。然而，在絲狀真菌中實(shí)施此類方法仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榕cSaccharomyces cerevisiae和Escherichia coli等模式生物相比，合成生物學(xué)工具箱還不夠成熟（Li等人，2025年；Mózsik等人，2025年）。最近的研究表明，如Cre/LoxP和Flp/FRT這樣的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)高效的大DNA片段整合（Roux和Chooi，2022年；Sun等人，2025年；Yao等人，2025年）。LoxP有許多不同的突變體（例如Lox2272和Lox511）（Cautereels等人，2024年；Missirlis等人，2006年）；然而，尚未有關(guān)于在絲狀真菌中使用正交Cre-lox進(jìn)行多基因位點(diǎn)整合的報(bào)告。
在這里，我們基于正交Cre-lox重組系統(tǒng)，在一種產(chǎn)生ECB的菌株中開(kāi)發(fā)了一個(gè)靶向的雙基因位點(diǎn)整合平臺(tái)。該遺傳工具允許進(jìn)行約30 kb的單點(diǎn)插入和10 kb DNA片段的同步雙點(diǎn)整合，從而實(shí)現(xiàn)快速的組合基因組整合和復(fù)雜生物合成途徑的優(yōu)化。利用這一平臺(tái)，我們系統(tǒng)地識(shí)別了非典型和天然氨基酸前體供應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的七個(gè)限速步驟。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)關(guān)鍵基因odeA，它參與亞油酸的合成，其溫度依賴性調(diào)控模式與ani基因簇相同。溫度變化會(huì)改變脂肪酸組成，從而影響ECB的產(chǎn)量。高效整合平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了組合多基因調(diào)控，通過(guò)系統(tǒng)化的代謝工程，使ECB的產(chǎn)量達(dá)到了3.5 ± 0.2 g/L，這是迄今為止報(bào)道的最高水平。
章節(jié)摘錄
正交Cre-lox重組技術(shù)在A. nidulans中實(shí)現(xiàn)雙基因位點(diǎn)基因組整合
為了實(shí)現(xiàn)生物合成途徑的組合優(yōu)化的一步多基因整合，我們最初開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于正交Cre/lox重組系統(tǒng)的雙基因位點(diǎn)、大片段基因組整合平臺(tái)（圖2A）。親本菌株為A. nidulans BGCm5，這是一種產(chǎn)生ECB的菌株，其多個(gè)副產(chǎn)物BGC已被失活（Tian等人，2025年）。該菌株經(jīng)過(guò)多重堿基編輯，以失活非同源末端連接酶NkuA和
討論
在這項(xiàng)研究中，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)在A. nidulans中的多重基因組整合平臺(tái)，利用正交Cre-lox重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的雙基因位點(diǎn)基因組插入。利用該系統(tǒng)，我們重建并優(yōu)化了ECB的生物合成途徑，ECB是一種臨床上重要的抗真菌前體。系統(tǒng)化的途徑重構(gòu)使ECB的產(chǎn)量提高了3.5 ± 0.2 g/L，這是迄今為止報(bào)道的最高產(chǎn)量。我們的工作提供了一種穩(wěn)健且穩(wěn)定的工程方法
菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
Escherichia coli Trelief ? 5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（DLC101，Tsingke Biotech，北京，中國(guó)）被用作質(zhì)粒制備的宿主，工程改造后的E. coli菌株在含有卡那霉素（100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中于28-37 °C下培養(yǎng)，用于克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增。Saccharomyces cerevisiae BY4741化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（CC301，Coolaber Biotech，北京，中國(guó)）被用作構(gòu)建大型質(zhì)粒的宿主，S. cerevisiae細(xì)胞在30 °C下培養(yǎng)
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Wenqing Lou：可視化、方法學(xué)、研究。Liyuan Yue：可視化、方法學(xué)、研究。Yanling Li：寫作——審稿與編輯、寫作——初稿、監(jiān)督、資源管理、研究、概念化。Chao Meng：監(jiān)督、方法學(xué)、研究。Dongfang Zhang：寫作——初稿、驗(yàn)證、資源管理、方法學(xué)、研究、數(shù)據(jù)管理。Yue Zhang：寫作——初稿、驗(yàn)證、方法學(xué)、研究、數(shù)據(jù)管理，未引用參考文獻(xiàn)
Cockshott和Sullivan，2001年；Feng和Leonard，1998年；Hüttel等人，2016年；Ma等人，2025年；Mózsik等人，2021年；Rezazade和Dehghani，2022年；Shimizu和Katsuki，1975年。
遵守倫理要求
本文不包含任何涉及人類或動(dòng)物的研究。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒(méi)有已知的可能會(huì)影響本文所述工作的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系。
致謝
本工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)22578253）、山東泰山獎(jiǎng)學(xué)金（編號(hào)tsqn202306269）、山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)2024HWYQ-057；編號(hào)ZR2024QC029）以及教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的開(kāi)放資助項(xiàng)目（編號(hào)KLIB-KF202403）的支持。
