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本文報道了利用人工智能（AI）驅(qū)動的蛋白質(zhì)從頭設(shè)計技術(shù)，成功開發(fā)出新型CRISPR-Cas13a高效抑制劑（AIcr）。研究者針對目前缺乏天然抑制劑的LbuCas13a系統(tǒng)，設(shè)計了特異性靶向其HEPN核酸酶結(jié)構(gòu)域的人工抑制劑，并在體外、細(xì)菌及人源細(xì)胞中驗證了其強效抑制活性與作用機制，為RNA編輯工具的精準(zhǔn)控制提供了新工具。
De novo design of potent CRISPR–Cas13 inhibitors
CRISPR-Cas系統(tǒng)作為革命性的基因編輯工具，其活性調(diào)控對于應(yīng)用安全性至關(guān)重要。抗CRISPR（Acr）蛋白是噬菌體編碼的天然抑制劑，可精確調(diào)控CRISPR-Cas系統(tǒng)的活性。然而，針對生物技術(shù)應(yīng)用中重要的CRISPR系統(tǒng)（如Cas13）的Acr數(shù)量稀少且發(fā)現(xiàn)困難。本研究突破傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)模式的限制，采用人工智能驅(qū)動的從頭蛋白質(zhì)設(shè)計方法，成功開發(fā)出新型人工設(shè)計Cas13抑制劑（AIcr）。
引言背景
CRISPR-Cas效應(yīng)蛋白通過CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)，特異性識別并切割外源遺傳物質(zhì)。其中II類CRISPR效應(yīng)器（Cas9、Cas12和Cas13）已徹底改變了生物技術(shù)領(lǐng)域。特別是靶向RNA的VI型CRISPR-Cas13系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)錄組工程和診斷應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力。Acr蛋白能夠通過多種機制抑制CRISPR-Cas系統(tǒng)活性，但目前已知的Cas13抑制劑僅有三種，許多具有應(yīng)用價值的Cas13系統(tǒng)仍缺乏有效調(diào)控工具。
De novo design of Cas13 nuclease inhibitors
研究團隊以LeptotrichiabuccalisCRISPR-Cas13a（LbuCas13a）為模型系統(tǒng)，針對其高度保守的HEPN核酸酶結(jié)構(gòu)域開展抑制劑設(shè)計。利用RoseTTAFold-Diffusion（RFdiffusion）進行蛋白質(zhì)支架生成，并結(jié)合ProteinMPNN進行逆折疊設(shè)計，產(chǎn)生了靶向HEPN核酸酶活性中心關(guān)鍵殘基（H473）及鄰近疏水殘基（V411、V421和F995）的抑制劑設(shè)計方案。從10,000個初始設(shè)計中篩選出96個候選分子，通過多重結(jié)構(gòu)比對分析顯示這些AIcr設(shè)計具有高度結(jié)構(gòu)多樣性，且與已知蛋白質(zhì)無顯著相似性。
AIcrs inhibit Cas13 nuclease activity
建立細(xì)胞游離表達(dá)系統(tǒng)和高通量Cas13a活性篩選平臺后，研究發(fā)現(xiàn)10個AIcr設(shè)計能顯著抑制LbuCas13a的核酸酶活性（抑制率>50%）。通過生物層干涉技術(shù)驗證結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)7個AIcr能與激活的LbuCas13a-crRNA-aRNA復(fù)合物結(jié)合。經(jīng)過純化驗證，最終選定三個最具潛力的抑制劑（A11、C10和H8）命名為AIcrVIA1、AIcrVIA2和AIcrVIA3進行深入研究。
AIcrVIAs are potent, stable and true to design
活性測定顯示三種AIcrVIA均具有納摩爾級別的抑制活性（IC50約7 nM）。圓二色光譜分析證實這些AIcr的二級結(jié)構(gòu)與設(shè)計預(yù)測高度一致，且具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。特別是AIcrVIA1的X射線晶體結(jié)構(gòu)解析（分辨率1.9 ?）顯示其實際結(jié)構(gòu)與AlphaFold2預(yù)測模型高度吻合（均方根偏差約1.7 ?），驗證了設(shè)計流程的可靠性。
AIcrVIAs are specific LbuCas13a HEPN nuclease inhibitors
作用機制研究表明，AIcrVIA通過競爭性抑制機制特異性靶向LbuCas13a的HEPN核酸酶活性位點。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析（分辨率3.55 ?）直觀展示了AIcrVIA1與LbuCas13a復(fù)合物的相互作用模式，特別是與β鏈元件（殘基409-421）的密切接觸。缺失該元件的LbuCas13a突變體完全喪失了AIcr抑制敏感性，證實了該區(qū)域?qū)σ种苿┙Y(jié)合的關(guān)鍵作用。交叉抑制實驗顯示AIcrVIA對LbaCas13a、TccCas13a和RfxCas13d等同源蛋白無抑制活性，體現(xiàn)了高度的特異性。
AIcrs inhibit Cas13a-mediated activity in cells
在細(xì)菌系統(tǒng)中，AIcrVIA能有效恢復(fù)被LbuCas13a抑制的T4噬菌體復(fù)制能力。在HEK293T細(xì)胞中建立的熒光報告系統(tǒng)證明，AIcrVIA可顯著抑制Cas13a介導(dǎo)的GFP基因沉默效應(yīng)，其中AIcrVIA1和AIcrVIA2展示出良好的細(xì)胞相容性，而AIcrVIA3則表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒性。
討論與展望
本研究首次實現(xiàn)了CRISPR-Cas13抑制劑的從頭設(shè)計，僅用8周時間便獲得成功率為10%的高效抑制劑，遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)方法。AIcr的設(shè)計策略可推廣至其他CRISPR系統(tǒng)及核酸酶的設(shè)計，為精準(zhǔn)控制基因編輯工具提供了新范式。隨著AI蛋白質(zhì)設(shè)計技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是AlphaFold3、Boltz-1等新工具在蛋白質(zhì)-核酸相互作用預(yù)測方面的進步，定制化抑制劑設(shè)計將在研究、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和微生物學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
該方法克服了天然Acr發(fā)現(xiàn)的速度限制，為CRISPR-Cas技術(shù)的安全應(yīng)用提供了強大工具。未來，通過整合更多實驗數(shù)據(jù)對AI模型進行再訓(xùn)練，將進一步提高了設(shè)計成功率和抑制劑性能，推動精準(zhǔn)基因組編輯技術(shù)的發(fā)展。
