《Process Biochemistry》：Synthesis, characterization, antifungal and SERS analysis of mycosynthesized silver nanoparticles against
Aspergillus parasiticus
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CRISPR修飾與親本黃曲霉合成銀納米顆粒并評估其抗真菌活性，通過多技術表征和表面增強拉曼光譜分析發現CRISPR修飾菌株產AgNPs效果更優。
作者：Anam Ijaz 和 Muhammad Rizwan Javed
生物催化與蛋白質工程研究小組（BPERG），費薩拉巴德政府學院大學生物信息學與生物技術系（GCUF），阿拉瑪·伊克巴爾路，費薩拉巴德-38000，巴基斯坦
摘要
在當前十年中，微生物納米技術在生產關鍵酶和次級代謝產物方面取得了顯著進展，這些產物可作為天然還原劑將金屬離子還原為納米顆粒。在本研究中，通過CRISPR改造的（M-AgNPs）及其原始菌株黑曲霉（P-AgNPs）評估了AgNPs的合成過程。這些AgNPs通過UV-Vis光譜、FTIR、TEM、SEM、DLS和XRD進行了表征。分析結果顯示，合成的AgNPs在420納米處具有特征性峰值，具有相應的官能團，呈球形，平均直徑分別為8納米和14納米，并具有晶體結構。此外，還評估了AgNPs對產生黃曲霉毒素的寄生曲霉的抗菌活性，并測定了最小抑菌濃度（MIC）和最大殺菌濃度（MFC）。M-AgNPs和P-AgNPs的MIC分別為18.75微克/毫升和37.2微克/毫升，而它們的MFC分別為75微克/毫升和150微克/毫升。通過SERS還研究了真菌生物分子的生化變化，發現隨著AgNPs濃度的增加，這些變化更為明顯。M-AgNPs對寄生曲霉的抗菌活性高于P-AgNPs。本研究首次提供了針對寄生曲霉的AgNPs的詳細SERS分析，有助于闡明抗菌劑的作用機制及其控制真菌感染的潛力。
引言
納米技術是指在1至100納米的納米尺度范圍內制造新型材料。在過去二十年里，由于其眾多應用，它已成為最廣泛探索和最具革命性的技術領域之一。用于合成金屬納米顆粒（NPs）的綠色技術是一個令人興奮的前沿研究領域[1]。由于傳統方法存在環境和健康風險，綠色納米技術的應用正在顯著增加。傳統的合成方法包括物理方法（如離子濺射、激光燒蝕、球磨）和化學方法（如多元醇合成、噴霧熱解、溶膠-凝膠法），這些方法成本高昂且涉及使用有毒化學物質，從而帶來嚴重的生態風險。而利用細菌、植物、藻類或真菌的生物合成方法由于無毒、經濟高效和快速合成而成為綠色化學中的環保選擇[2]。生物合成方法的基本原理是利用生物系統中的生物分子作為還原劑將金屬離子轉化為NPs[3]。
微生物由于其簡單的生長要求和大規模生產的潛力，成為納米顆粒合成的核心工廠。然而，由于微生物細胞結構和代謝途徑的多樣性，支持微生物NPs形成的機制尚未完全理解。多項研究表明，微生物基因、輔因子、蛋白質、肽、酶和有機分子參與了通過細胞內或細胞外過程將金屬離子還原為NPs的解毒和抗性機制[4]。微生物納米技術是納米技術與真菌學之間的交叉學科，它利用真菌進行NPs的合成。在各種生物納米工廠中，真菌是理想的候選者，因為它們具有豐富的生物量、高金屬積累能力、耐極端條件以及分泌大量生物活性代謝產物的能力（約6,400種），這些代謝產物包括蛋白質和酶，可以作為天然的還原劑和穩定劑，從而消除了對有毒化學物質和高能量輸入的需求[5]。此外，由真菌代謝產物介導的細胞外合成過程簡化了下游處理，無需進行細胞裂解，使得整個過程更加高效且環保。與細菌中的典型細胞內生物合成相比，純化過程也更加便捷[6]。在先前的文獻中，已經研究了包括曲霉屬[7]、鐮刀菌屬[8]、青霉屬[9]在內的多種絲狀真菌在銀納米顆粒（AgNPs）合成方面的潛力。不同真菌物種合成的NPs的物理化學性質差異可歸因于它們廣泛的代謝產物譜。許多研究發現，酶通過與金屬離子相互作用在NPs的生物合成和制備中起著重要作用[2]，[10]。已經研究了纖維素酶作為封裝劑在穩定AgNPs、防止金屬離子聚集方面的有效性[11]。在一項研究中，α-淀粉酶有助于合成22-44納米大小的六邊形和三角形AgNPs[12]；而在另一項研究中，使用漆酶合成了具有抗菌特性的球形AgNPs[13]。這些觀察結果表明，真菌代謝產物和酶在合成具有多種特性的NPs中起著重要作用。
在各種金屬納米顆粒中，銀納米顆粒（AgNPs）在醫療保健、催化、成像、電子和光電子學等領域具有重要的應用價值，因為它們具有優異的電導率、光學性能和熱導率。AgNPs因其多功能性和抗菌特性而處于納米技術的前沿[14]。它們的高表面積和小尺寸增強了與微生物細胞膜的相互作用，從而表現出廣泛的抗菌活性[15]。AgNPs對微生物細胞的作用機制是由于它們在細胞膜上的積累導致膜穿孔，破壞代謝途徑，并損害DNA、蛋白質和酶等關鍵生物分子，從而抑制病原體復制[16]，[17]，[18]，[19]。納米技術的進步擴展了AgNPs的應用范圍，無論是單獨使用還是作為基于Ag的雙金屬納米復合材料，都因其有效的抗菌性能和良好的幾何結構及物理化學特性而受到關注。它們在生物醫學、疾病診斷與治療、傷口愈合、食品安全和安全等多個工業領域的應用已有報道[5]，[20]。
由各種真菌引起的食物傳播感染在全球范圍內帶來了嚴重的健康風險。據估計，每年有650萬人患有侵襲性真菌感染，死亡率為380萬人[21]。全球報告了許多真菌感染病例，包括念珠菌病（70萬例）、曲霉病（25萬例）、肺孢子菌肺炎（50萬例）和肺曲霉病（超過300萬例）[22]。食品和谷物中的霉菌毒素（真菌次級代謝產物）對人類和牲畜構成了重大威脅。霉菌毒素由曲霉屬產生，即使低濃度也對人類和牲畜具有毒性。最危險的霉菌毒素包括黃曲霉毒素、伏馬菌素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和三萜烯[23]。其中，黃曲霉毒素尤其令人擔憂，因為它們對人類和動物具有致癌性。寄生曲霉等曲霉屬在食品加工、收獲前后、運輸和儲存過程中會產生黃曲霉毒素（AFs）。四種天然存在的AFs，即黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，被認為是強效的誘變劑、致癌物和致畸物。食品中黃曲霉毒素的存在引起了高度關注，并在許多國家受到密切監測和持續控制。納米生物技術的最新進展促進了具有有效抗黃曲霉毒素能力的新型NPs的合成[24]。
鑒于AgNPs作為抗菌劑的重要性，在本研究中，利用CRISPR改造的（M-AgNPs）和原始菌株黑曲霉在細胞外合成AgNPs。通過UV-Vis光譜、TEM（透射電子顯微鏡）、SEM（掃描電子顯微鏡）、DLS（動態光散射）對合成的AgNPs進行了合成和形態分析，而它們的化學性質及參與制備的官能團則通過XRD（X射線衍射）和FTIR（傅里葉變換紅外光譜）進行了確定。此外，還全面評估了合成的M-AgNPs和P-AgNPs對產生黃曲霉毒素的寄生曲霉的抗菌活性。據我們所知，這項研究是首次通過SERS（表面增強拉曼光譜）在分子水平上描述微生物源AgNPs對寄生曲霉的影響。因此，本研究的目標是利用CRISPR改造的（M-AgNPs）和原始菌株黑曲霉合成AgNPs，并評估其在體外生物應用中的潛力。研究結果將有助于了解穩定化合物在微生物源AgNPs合成中的作用及其抗菌特性。
章節摘錄
真菌菌株的培養和接種液制備
費薩拉巴德政府學院大學生物信息學與生物技術系（GCUF）生物催化與蛋白質工程研究小組（BPERG）已有的內源性分離的黑曲霉菌株被用于通過先前描述的程序[25]對creA基因進行CRISPR-Cas9編輯。進一步篩選了CRISPR改造菌株和原始菌株，以生產水解酶，如外切纖維素酶、內切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶。
AgNPs的微生物合成
據報道，鐮刀菌氧孢子菌等絲狀真菌的無細胞濾液中存在的水解酶占AgNPs合成、制備和穩定過程中所有分子的約52.6%[36]。碳代謝物抑制（CCR）是產生纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶和阿拉伯糖酶等水解酶的主要障礙之一。這些降解纖維素的酶在其啟動子區域含有調控元件
結論
綠色化學方法因其清潔、經濟高效、環保和生物相容性以及減少有害副產物的特性而受到越來越多的關注。本研究展示了使用CRISPR改造的黑曲霉菌株的無細胞濾液合成AgNPs的方法，這些菌株含有參與AgNPs還原、封蓋/穩定的重要次級代謝產物、蛋白質和酶。通過UV-Vis光譜、FTIR、TEM、SEM等手段對綠色合成的AgNPs進行了物理化學表征
作者聲明
所有作者都做出了實質性貢獻，并同意提交該手稿，同時承認手稿中引用的已發表的工作。此外，該手稿尚未發表或提交給任何其他期刊，如果被接受，也不會在其他地方發表。
CRediT作者貢獻聲明
Anam Ijaz：撰寫——原始草稿、驗證、方法學、研究、正式分析。Muhammad Rizwan Javed：撰寫——審閱與編輯、驗證、監督、資源提供、概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明以下可能構成潛在利益沖突的財務利益/個人關系：Muhammad Rizwan Javed博士報告稱獲得了巴基斯坦高等教育委員會的財務支持。如果還有其他作者，他們聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
作者們沒有已知的利益沖突可能影響本文所述的工作。特別感謝費薩拉巴德農業大學（費薩拉巴德，38000）化學系的研究人員在SERS分析方面提供的技術支持。同時，也非常感謝費薩拉巴德政府學院大學生物技術系（GCUF）和巴基斯坦高等教育委員會（HEC）提供的財務支持
