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CRISPR/Cas12a驅(qū)動(dòng)的電化學(xué)生物傳感器，用于超靈敏檢測海鮮樣本中的副溶血性弧菌

《Analytica Chimica Acta》：CRISPR/Cas12a empowered electrochemical biosensor for ultrasensitive detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples

【字體：大中小】 時(shí)間：2026年01月27日 來源：Analytica Chimica Acta 6

編輯推薦：

　　建立基于PCR和發(fā)夾DNA探針的電化學(xué)CRISPR生物傳感器，用于高靈敏度檢測副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）。通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA，結(jié)合CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的轉(zhuǎn)切割效應(yīng)和電化學(xué)信號(hào)檢測，實(shí)現(xiàn)檢測限達(dá)1.17拷貝/μL（DNA）、12.3 CFU/g（人工污染蝦樣），與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果高度一致。發(fā)夾DNA探針設(shè)計(jì)有效克服了空間位阻問題，顯著提升Cas12a的轉(zhuǎn)切割效率。該技術(shù)兼具快速性、高靈敏度和現(xiàn)場適用性，為復(fù)雜食品基質(zhì)中V. parahaemolyticus檢測提供新方案。

李永芳|陳軒|楊哲勛|王志軍|王瑞

佛山大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，中國佛山，528231

摘要

快速且超靈敏地檢測副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱Vp）對(duì)于早期預(yù)防食源性疾病具有重要意義。傳統(tǒng)的Vp檢測方法耗時(shí)較長，靈敏度和特異性較低。本研究將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與電化學(xué)傳感技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)合，開發(fā)了一種基于PCR的E-CRISPR生物傳感器用于Vp的檢測。從Vp中提取的目標(biāo)DNA通過PCR擴(kuò)增后，激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在電極上切割甲基藍(lán)（MB）標(biāo)記的發(fā)夾DNA探針，從而產(chǎn)生顯著的電電流變化。使用發(fā)夾DNA探針可以減少Cas12a切割過程中的空間阻礙，提高切割效率和傳感性能。在最佳條件下，檢測限分別達(dá)到1.17拷貝/μL（基因組DNA）、1.23 CFU/mL（標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌）和12.3 CFU/g（人工污染的蝦樣本）。此外，基于PCR的E-CRISPR生物傳感器具有優(yōu)異的重現(xiàn)性和特異性。最重要的是，該生物傳感器在18個(gè)海產(chǎn)品樣本的檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果完全一致，證實(shí)了其在復(fù)雜食品基質(zhì)中監(jiān)測Vp的廣泛適用性。我們開發(fā)的E-CRISPR生物傳感器是一種簡單、快速且超靈敏的Vp檢測方法，也可用于其他食源性病原體的檢測。

引言

副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus，簡稱Vp）是導(dǎo)致水產(chǎn)品食源性疾病爆發(fā)的主要致病菌。食用受污染的海產(chǎn)品可能導(dǎo)致食物中毒、嚴(yán)重的胃腸道疾病，甚至危及生命[1]、[2]、[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年至2022年間中國共有23818例由Vp引起的食源性疾病病例，患者年齡從2個(gè)月到100歲不等，多數(shù)病例發(fā)生在夏季的沿海地區(qū)[4]。鑒于Vp的強(qiáng)增殖能力，快速且超靈敏地檢測海產(chǎn)品中的Vp對(duì)于早期預(yù)防病原體感染至關(guān)重要。傳統(tǒng)的Vp檢測方法包括金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法、免疫測定法和基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的分子診斷方法。培養(yǎng)法勞動(dòng)強(qiáng)度大且耗時(shí)較長[5]，從取樣到得出結(jié)果需要3-5天，并且需要特定的培養(yǎng)條件。免疫測定法（如側(cè)向流動(dòng)免疫測定法）操作簡便、快速且成本低廉，但靈敏度不足，存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)[6]。實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）靈敏度高，但需要昂貴的儀器和專業(yè)操作人員，限制了其在資源有限地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用[7]。因此，迫切需要開發(fā)一種快速、超靈敏、特異性強(qiáng)且可在現(xiàn)場使用的Vp檢測方法。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）系統(tǒng)因其單堿基識(shí)別特異性和高效率的切割活性而在核酸檢測中受到廣泛關(guān)注[8]、[9]。Cas12a-crRNA復(fù)合物能夠識(shí)別含有PAM序列（TTTN）的雙鏈DNA（dsDNA）。crRNA識(shí)別目標(biāo)后，Cas12a被激活并切割目標(biāo)DNA（順式切割），同時(shí)無差別地切割附近的單鏈DNA（ssDNA）（反式切割）[10]、[11]。由于Cas12a的切割速度高達(dá)每秒1250次[12]，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)具有信號(hào)放大的功能。快速的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和易于操作的特點(diǎn)使其成為理想的現(xiàn)場檢測工具。大多數(shù)基于CRISPR的生物傳感技術(shù)依賴于熒光報(bào)告基因或側(cè)向流動(dòng)條。然而，這些方法的定量檢測需要昂貴的熒光讀數(shù)設(shè)備，降低了實(shí)際應(yīng)用的便利性。因此，需要一種簡單的讀數(shù)方法來增強(qiáng)CRISPR/Cas系統(tǒng)的實(shí)用性和功能性。

電化學(xué)傳感技術(shù)具有高靈敏度、數(shù)值讀數(shù)和易于微型化的優(yōu)勢(shì)[13]。Dai等人[14]首次將電化學(xué)報(bào)告基因探針固定在電極表面，開發(fā)出基于CRISPR/Cas12a的電化學(xué)傳感器（E-CRISPR）。CRISPR切割后報(bào)告基因探針的數(shù)量變化可以通過電流變化來讀取，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和定量檢測[15]。然而，E-CRISPR在食品安全監(jiān)測中的應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，大多數(shù)已開發(fā)的E-CRISPR傳感器不依賴擴(kuò)增[16]、[17]、[18]，其靈敏度通常在fM級(jí)別，無法滿足復(fù)雜食品基質(zhì)中微量目標(biāo)物質(zhì)的超靈敏檢測要求[19]、[20]。其次，電極上Cas蛋白與電化學(xué)報(bào)告基因之間的空間阻礙限制了Cas12a的切割效率，從而降低了檢測靈敏度[21]、[22]。因此，迫切需要開發(fā)具有更高檢測靈敏度的E-CRISPR生物傳感器以適應(yīng)多樣的食品樣本基質(zhì)。

本文開發(fā)了一種基于PCR的快速E-CRISPR生物傳感器用于Vp檢測。首先使用兩溫度控制的快速PCR擴(kuò)增Vp的基因組DNA，然后擴(kuò)增產(chǎn)物激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在電極上進(jìn)行切割。PCR和CRISPR/Cas12a的雙重?cái)U(kuò)增確保了高檢測靈敏度。此外，使用發(fā)夾DNA探針提高了Cas12a的切割效率。所開發(fā)的E-CRISPR生物傳感器能夠在實(shí)際蝦樣本中檢測到Vp，最低檢測限為12.3 cfu/g，符合中國對(duì)預(yù)包裝水產(chǎn)品中Vp檢測的食品安全標(biāo)準(zhǔn)。我們提出的方法為食品安全應(yīng)用中的快速超靈敏細(xì)菌檢測提供了新的解決方案。

試劑和材料

本研究中使用的所有DNA和RNA寡核苷酸均由Sangon Biotech（上海）有限公司合成。具體序列列于表S1中。重組RNase抑制劑和SpeedSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa Bio。LbaCas12a（Cpf1）購自Haihexi Biotechnology（上海）有限公司。四氯金酸（HAuCl₄）、6-巰基-1-己醇（MCH）、鐵氰化鉀（K₃[Fe(CN)₆）、鐵氰化鉀（K₄[Fe(CN)₆）和氯化鉀（KCl）也用于實(shí)驗(yàn)。

基于PCR的E-CRISPR生物傳感器檢測Vp的原理

基于PCR和發(fā)夾DNA探針的E-CRISPR生物傳感器檢測Vp的超靈敏原理如圖1所示。從蝦樣本中提取Vp的基因組DNA后，通過PCR擴(kuò)增獲得大量目標(biāo)dsDNA。將甲基藍(lán)（MB，3’端）和硫醇基團(tuán)（5’端）標(biāo)記的發(fā)夾DNA探針通過Au-S鍵固定在AuNPs修飾的SPCE上。在Vp存在的情況下，crRNA識(shí)別目標(biāo)DNA并激活Cas12a。

結(jié)論

本研究成功開發(fā)了一種基于PCR和發(fā)夾DNA探針的CRISPR電化學(xué)生物傳感器，用于超靈敏檢測副溶血性弧菌。通過PCR獲得大量目標(biāo)產(chǎn)物，發(fā)夾DNA探針顯著提高了Cas12a的切割效率，從而大大提升了CRISPR電化學(xué)生物傳感器的靈敏度。在優(yōu)化條件下，該傳感器對(duì)基因組DNA和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的檢測限達(dá)到了理想水平。

CRediT作者貢獻(xiàn)聲明

李永芳：撰寫 – 審稿與編輯、監(jiān)督、項(xiàng)目管理、方法設(shè)計(jì)、資金申請(qǐng)、數(shù)據(jù)分析、概念構(gòu)建。陳軒：撰寫 – 初稿撰寫、數(shù)據(jù)分析。楊哲勛：實(shí)驗(yàn)研究。王志軍：實(shí)驗(yàn)研究。王瑞：撰寫 – 審稿與編輯、驗(yàn)證、資金申請(qǐng)