《aBIOTECH》：FUL1 is a key regulator of grain morphology, stem development and other shoot characteristics in Sorghum bicolor L. Moench
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本研究針對(duì)高粱中AP1/FUL-like基因家族功能未知的問題，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)SbFUL1進(jìn)行功能解析。研究發(fā)現(xiàn)SbFUL1敲除突變體出現(xiàn)開花延遲、花序結(jié)構(gòu)改變、籽粒形態(tài)異常等表型，并首次發(fā)現(xiàn)該基因突變導(dǎo)致莖稈增粗、機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)的新表型。DAP-seq分析揭示了SbFUL1可能通過調(diào)控果膠生物合成及細(xì)胞壁重塑通路基因影響莖稈發(fā)育。該研究為作物改良提供了新靶點(diǎn)，發(fā)表于《aBIOTECH》。
糧食產(chǎn)量是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的核心目標(biāo)，而谷物籽粒的形態(tài)和產(chǎn)量構(gòu)成因素一直是育種家關(guān)注的焦點(diǎn)。在眾多谷物中，高粱作為一種重要的耐旱作物，其產(chǎn)量潛力與花序結(jié)構(gòu)和開花時(shí)間密切相關(guān)。然而，與水稻、小麥等作物相比，高粱花器官發(fā)育的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究相對(duì)滯后。特別是APETALA1/FRUITFULL (AP1/FUL)基因家族，雖然在擬南芥等模式植物中被證實(shí)是花器官發(fā)育和開花時(shí)間的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但在高粱中的具體功能尚未明確。
隨著基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，CRISPR/Cas9為作物功能基因組研究提供了強(qiáng)大工具。盡管高粱在組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面曾被認(rèn)為是難轉(zhuǎn)化物種，但近年來隨著形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)子的應(yīng)用和高粱特異性啟動(dòng)子的開發(fā)，其基因編輯效率已顯著提高。在此背景下，研究人員對(duì)高粱SbFUL1基因展開了系統(tǒng)性功能研究，旨在揭示該基因在高粱生長(zhǎng)發(fā)育中的多重作用。
本研究采用了多種關(guān)鍵技術(shù)方法：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建SbFUL1敲除突變體；通過溫室和生長(zhǎng)箱進(jìn)行不同光周期條件下的表型鑒定；使用DAP-seq(DNA親和純化測(cè)序)分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；借助材料力學(xué)測(cè)試儀量化莖稈機(jī)械強(qiáng)度；采用組織切片和顯微觀察分析莖稈解剖結(jié)構(gòu)。
2.1. CRISPR/Cas9編輯的SbFUL1突變體
研究人員針對(duì)高粱FUL1同源基因(Sobic.001G086500)設(shè)計(jì)兩個(gè)gRNA，通過共轟擊法獲得轉(zhuǎn)基因植株。分離得到兩個(gè)純合突變體：ful1-1攜帶1個(gè)核苷酸缺失，導(dǎo)致提前終止密碼子，僅編碼8/246個(gè)野生型氨基酸；ful1-2為-2nt缺失型，編碼67/246個(gè)野生型氨基酸。兩種突變均導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短，為功能缺失型突變體。
2.2. SbFUL1突變體顯示選擇性功能保守
突變體表現(xiàn)出顯著的開花延遲，在長(zhǎng)日照、短日照和自然日照條件下分別延遲約14天、6-8天和7-10天。同時(shí)，突變體花序長(zhǎng)度增加約20%，但初級(jí)分枝密度不變，導(dǎo)致分枝總數(shù)增加。值得注意的是，花梗長(zhǎng)度減少約50%，表明SbFUL1參與花器官支撐結(jié)構(gòu)的發(fā)育調(diào)控。
2.3. 對(duì)籽粒發(fā)育和形態(tài)的影響
SbFUL1敲除導(dǎo)致籽粒形態(tài)異常，出現(xiàn)皺縮種子比例增加的現(xiàn)象。內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析顯示異常籽粒的胚乳發(fā)育畸形，玻璃質(zhì)胚乳減少，粉質(zhì)胚乳增加。通過源-庫(kù)關(guān)系調(diào)控實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，減源(去葉)和減庫(kù)(半穗)處理均不能完全消除籽粒異常表型，表明該表型主要源于基因功能缺失而非單純的源庫(kù)關(guān)系改變。
2.4. 高粱中FUL1敲除賦予更強(qiáng)莖稈
研究發(fā)現(xiàn)SbFUL1敲除導(dǎo)致莖稈直徑增加約2倍，機(jī)械強(qiáng)度提高近50%，能承受的斷裂力從野生型的18N增加至27N。顯微結(jié)構(gòu)分析顯示突變體維管束面積顯著增大，但木質(zhì)化程度無明顯變化，表明莖稈強(qiáng)度增強(qiáng)可能與細(xì)胞壁成分改變而非木質(zhì)素含量相關(guān)。
2.5. SbFUL1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的全基因組鑒定
DAP-seq分析鑒定出540個(gè)SbFUL1潛在靶基因，其中355個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)。顯著富集的通路包括囊泡運(yùn)輸、翻譯延伸因子活性和植物器官發(fā)育。特別值得注意的是，多個(gè)果膠甲基酯酶(PMEs)和果膠甲基酯酶抑制劑(PMEIs)基因被鑒定為SbFUL1的潛在靶標(biāo)，為解釋莖稈表型提供了分子機(jī)制線索。
研究討論部分強(qiáng)調(diào)，本研究不僅證實(shí)了SbFUL1在開花時(shí)間和花器官發(fā)育中的保守功能，還發(fā)現(xiàn)了該基因?qū)ηo稈發(fā)育的新穎調(diào)控作用。與傳統(tǒng)認(rèn)知不同，SbFUL1可能通過調(diào)控果膠代謝相關(guān)基因影響細(xì)胞壁特性，進(jìn)而改變莖稈機(jī)械強(qiáng)度。這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了我們對(duì)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子功能多樣性的認(rèn)識(shí)。
該研究的創(chuàng)新性在于采用了全株水平的表現(xiàn)分析策略，揭示了SbFUL1的多效性功能遠(yuǎn)超先前預(yù)期。研究結(jié)果表明，利用花器官發(fā)育基因進(jìn)行作物改良具有巨大潛力，特別是在協(xié)調(diào)產(chǎn)量與抗倒伏性方面。未來研究應(yīng)關(guān)注環(huán)境因素對(duì)該基因功能的影響，以及其在不同遺傳背景下的表達(dá)效應(yīng)，為高粱分子設(shè)計(jì)育種提供理論依據(jù)。
這項(xiàng)由昆士蘭大學(xué)研究人員完成的工作，為理解高粱重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了新視角，展示了整合現(xiàn)代生物技術(shù)和傳統(tǒng)生理學(xué)研究在作物改良中的價(jià)值。隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善，類似SbFUL1這樣的多效性調(diào)控基因有望成為未來作物育種的重要靶點(diǎn)。
