成簇規律間隔短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR相關蛋白(Cas)系統是細菌和古菌中廣泛存在的可遺傳RNA介導的免疫系統。通過基因工程改造，科學家們建立了廣泛應用的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13堿基編輯系統。在單向導RNA(sgRNA)的引導下，Cas9蛋白利用其HNH和RuvC樣核酸酶結構域切割靶DNA，產生雙鏈斷裂(DSB)。DSB激活受體細胞啟動修復通路，包括非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HDR)，從而導致可遺傳的突變，如缺失、插入或替換（圖1A）。

盡管基于CRISPR/Cas9的基因敲除潛力巨大，但其主要依賴NHEJ，存在幾個挑戰，包括不可控地產生不同類型的突變以及較高的脫靶風險。為了滿足對更精確、多功能基因編輯工具的需求，研究人員將Cas9開發為蛋白質支架。隨后，基于CRISPR的激活、抑制、堿基編輯和引物編輯技術相繼出現，開啟了精準基因組編輯的時代。

堿基編輯器(BE)相較于先前的基因組編輯方法具有三個關鍵優勢：與傳統CRISPR/Cas9系統相比，通過在不形成DSB的情況下產生單核苷酸修飾，提高了精確度；與表觀遺傳工具不同，能夠產生永久性可遺傳突變；與引物編輯系統相比，使用更簡單的表達盒時效率更高。這些特性使堿基編輯特別適用于精準育種和治療應用。

BEs是通過將單鏈DNA(ssDNA) Cas9切口酶(Cas9n)與堿基脫氨酶融合而設計的，從而能夠在目標窗口內進行堿基修飾而不形成DSB（圖1B）。BEs增強的安全性使其在動物疾病模型和治療性基因編輯中具有重要價值。

在植物研究中，堿基編輯主要用于產生用于研究基因組功能或用于分子育種的突變材料。對植物基因組和基因功能的研究已經鑒定出許多與連續性狀突變相關的單核苷酸多態性(SNP)位點和啟動子基序，這些位點使用CRISPR/Cas DSB難以修飾。

單堿基編輯器特異性地將靶位點的一種堿基轉換為另一種。這些編輯器使用特定的酶修飾底物堿基，隨后通過錯配修復或糖基化酶消化產生脫嘌呤/脫嘧啶(AP)位點，從而實現精確的堿基修飾。單堿基編輯器有多種類型。根據其主要修復通路，單堿基編輯器可分為AP位點依賴型或AP位點非依賴型。

AP位點非依賴型堿基編輯器通過底物堿基脫氨產生脫氨堿基中間體，并依賴于跨損傷合成(TLS)聚合酶的寬松堿基識別能力。該機制可產生特定的堿基替換，包括CBE實現的C-to-T替換和ABE實現的A-to-G替換。CBE和ABE代表了最先進的單堿基編輯器，因其高效率、廣泛適用性和精確的編輯結果而在動植物研究中獲得廣泛應用。

CBE是科學研究中最早使用的單堿基編輯器。第一個此類堿基編輯器BE1由哈佛大學的David Liu團隊通過將dCas9與高活性大鼠胞苷脫氨酶rAPOBEC1融合而開發。dCas9-rAPOBEC1融合蛋白在sgRNA引導下，在靶位點的編輯窗口內通過脫氨作用將胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)。在DNA復制或修復過程中，U被解讀為胸腺嘧啶(T)，相應的鳥嘌呤(G)被轉化為腺嘌呤(A)，從而實現C•G到A•T的定向轉換（圖2）。

為了提高編輯效率，該研究團隊隨后在BE1的基礎上開發了BE2到BE4，顯著提高了CBE的性能。BE2通過在BE1中加入尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)來保護脫氨產生的尿嘧啶免受內源性尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG/UNG)的水解，從而提高了編輯效率。在BE3中，dCas9被僅切割ssDNA的Cas9n取代。這一變化確保靶點上的C脫氨形成U的同時，消除具有原始序列的互補鏈，從而防止U通過HDR修復通路恢復為C。BE4包含更多拷貝的UGI，增強了對U的保護，從而顯著提高了編輯效率并減少了副產物的產生。BE3和BE4的建立為CBE的進一步優化提供了關鍵框架。

TadA-8e（一種腺嘌呤特異性脫氨酶）進化出能夠進行胞嘧啶脫氨的變體是一項重大研究突破。研究人員使用噬菌體輔助連續進化(PACE)系統篩選了能夠脫氨胞嘧啶的TadA變體（TadA-CD、TadA-CDe）。他們引入了N46和Y73點突變，開發了CBE6，實現了更高的編輯效率并減少了非C-to-T堿基替換副產物的產生。TadA8e進化的胞嘧啶脫氨酶具有幾個優勢：它們比天然胞嘧啶脫氨酶更小，保持高編輯效率，并且脫靶率顯著降低。此外，它們更窄的編輯窗口有助于實現高精度的胞嘧啶堿基編輯。

ABE包含自然界中不存在的腺嘌呤脫氨酶TadA。自然系統中存在作用于游離腺嘌呤、腺苷和RNA腺苷的腺嘌呤脫氨酶；然而，它們不作用于雙鏈DNA或ssDNA中的腺嘌呤堿基。Gaudelli等人通過易錯PCR和在多種抗生素上進行選擇，對大腸桿菌中tRNA特異性腺嘌呤脫氨酶進行定向進化，構建了ABE7.10，最終開發出ssDNA腺嘌呤脫氨酶TadA7.10。ABE7.10是哺乳動物細胞中的腺嘌呤堿基編輯系統，可產生A-to-G轉換。ABE的作用模式與CBE相似：腺苷脫氨酶通過脫氨作用將A轉化為肌苷(I)，而I在修復過程中轉化為G。互補鏈上相應的T轉化為C，實現A•T到G•C的定向轉換。ABE的主要優勢在于I和G的結構相似性，這導致由切除引起的插入或缺失(indel)極少，從而實現更精確的腺嘌呤堿基編輯（圖2）。

依賴AP位點的BEs主要通過堿基切除修復(BER)通路發揮作用。它們利用糖基化酶消除脫氨產生的中間堿基或直接作用于底物堿基以產生AP位點。隨后，TLS聚合酶或DNA連接酶修復這些AP位點，隨機替換為其他堿基。或者，AP裂合酶去除AP位點，引起DSB并引入indel。通過AP位點修復產生的編輯產物主要取決于細胞修復機制和所使用的修復相關酶。在真核細胞中，特定堿基被替換的趨勢順序為C > G > A > T。目前，編輯產物的純度相對較低，堿基轉換類型表現出高度隨機性，難以人為控制。盡管如此，這類堿基編輯器的發展擴大了堿基編輯技術的應用范圍。

與CBE不同，C-to-G堿基編輯器(CGBE)通過外源表達尿嘧啶糖基化酶發揮作用，該酶切除胞嘧啶脫氨酶從胞嘧啶產生的尿嘧啶。這種切除產生AP位點，這些位點由DNA聚合酶或連接酶修復，導致堿基轉換。2021年，Kurt等人將大腸桿菌同源UNG(eUNG)與BE4max融合，排除UGI，開發了CGBE1。該系統在哺乳動物細胞中產生大量C-to-G突變。類似地，Zhao等人使用UNG切除U并啟動BER通路修復。通過將大腸桿菌UNG與APOBEC和nCas9融合，他們創建了APOBEC-nCas9-Ung，主要產生C-to-G突變，以及少量的C-to-A和C-to-T突變。研究人員將UNG變體轉化為以C為底物的糖基化酶變體。這導致了不依賴脫氨酶的CBE的開發，例如DAF-CBE和gCBE。在植物中，Zeng等人將CGBE應用于水稻，開發了CGBE-rUNG和CGBE-hUNG。CGBE在植物中主要產生C-to-T突變，C-to-G和C-to-A突變較少。基于這些發展，另一種方法通過結構分析出現。Chen等人分析了ABE8e復合物及其與底物相互作用的結構，戰略性地突變TadA8e中的關鍵氨基酸，包括V28、V30、N46和F84。他們產生了源自TadA8e (N46L)變體的C-to-G堿基編輯器(Td-CGBE)。該變體與UGI等融合，產生了編輯活性與BE4max相當的Td-CBE系列。

與ABE相比，AYBE（Y = T/C, K = T/G）通過外源表達嘌呤糖基化酶發揮作用，將細胞修復導向BER通路。該機制切除由TadA誘導的脫氧肌苷，產生AP位點，實現多樣的堿基編輯轉換。2023年，Tong等人將次黃嘌呤切除蛋白N-甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)和ABE8e融合，開發了AYBE，可產生A-to-Y突變。他們優化了該蛋白，獲得了AYBEv3，其編輯產物分布如下：A-to-C > A-to-K > indels (K = G/T)。這種編輯偏好可歸因于TLS聚合酶（如Pol η）的參與，其優先催化非Watson-Crick堿基配對。當AYBE引入非天然堿基中間體（腺嘌呤脫氨產生的肌苷衍生物）時，Pol η傾向于將其識別為嘌呤類似物，導致A-to-C/T顛換頻率增加。Tong等人證明過表達Pol η可增強A-to-T轉換的效率和純度。值得注意的是，AYBE編輯在植物中表現出不同的特性。將MPGv3與ABE融合后，該編輯器產生了A-to-G轉換，僅有極少的A-to-T和indel。A-to-C突變幾乎不存在。

基于尿嘧啶結合口袋和與尿嘧啶底物相互作用的關鍵氨基酸基團，Ye等人使用易錯PCR和細菌篩選定向改造人UNG，獲得了一種以T為底物的DNA糖基化酶，即胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG3)。通過將該酶與Cas9n融合，他們構建了不依賴脫氨酶的TBE，在大腸桿菌中實現了T-to-A堿基交換編輯，在哺乳動物細胞中實現了T-to-G堿基交換編輯。同時，He等人使用蛋白質語言模型指導UNG進化，創建了增強的胸腺嘧啶靶向變體(eTDG)。該變體被用于開發高效的TSBE（S = G/C），促進T-to-S (G/C)編輯。

基因組DNA中受損的G和A堿基經常發生脫嘌呤，并通過DNA糖基化酶產生AP位點。這一步啟動了BER通路，導致突變。Tong等人將MPG進化為一種識別G為其底物的糖基化酶。工程化的MPG變體（T199R/S230R/Q294R/D295R）被用于開發GBE，可產生G-to-Y (Y=C/T)堿基轉換。這一進展完善了堿基編輯系統的最后一塊拼圖。Wu等人通過將工程化的人尿嘧啶DNA糖基化酶變體與nCas9結合，開發了靶向胸腺嘧啶(pTGBE)和胞嘧啶(pCKBE)的不依賴脫氨酶的BEs。這些編輯器在水稻中實現了高達78.05%的T-to-G編輯效率和高達61.11%的C-to-G/T編輯效率，進一步擴展了植物中的堿基編輯工具箱。

總之，通過錯配修復修飾的底物堿基產生的編輯產物是可預測的。相比之下，通過修復的AP位點產生的堿基轉換仍然是不可預測的。AP位點非依賴型和AP位點依賴型BEs之間的主要區別在于產物純度。AP位點非依賴型BEs表現出更高的純度，更適用于精確的單堿基編輯。相比之下，AP位點依賴型BEs產生多樣化的編輯產物，有助于構建豐富的突變庫以研究基因功能。然而，BER通路會導致不可避免的indel副產物產生，因此不適合精確編輯。

除了識別基因差異和研究基因功能外，研究人員經常通過突變來探索基因的馴化和多樣化。這通常需要在靶位點內產生多個堿基變化。單堿基編輯受脫氨酶底物使用的限制，限制了靶位點內的堿基轉換數量，阻礙了復雜氨基酸修飾的生成。為了滿足這些需求，開發了雙堿基編輯器(DBE)。

關于DBE的研究最早于2020年在植物中進行。Li等人將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A、2×UGI和ecTadA-ecTadA7.10與CRISPR/Cas9n系統融合，從而在靶位點同時實現C-to-T和A-to-G堿基編輯。這種類型的DBE，稱為飽和靶向內源突變編輯器(STEME)，被用于研究水稻中的OsACC基因，從而鑒定出影響除草劑抗性的關鍵位點。因此，DBE是用于飽和突變和定向進化的強大工具。此外，Liang等人將CGBE和ABE整合，開發了一種多功能雙堿基編輯器，即AGBE，能夠產生四種類型的堿基轉換：A-G、C-G、C-T和C-A。這種方法大大增加了編輯產物的多樣性，使其適用于構建飽和突變庫。

與典型的基于蛋白質融合的DBE不同，Neugebauer等人利用噬菌體輔助連續進化系統將TadA突變為TadA-dual (R26G/V28A/A48R/Y73S/H96N)變體，該變體同時對其靶位點的胞嘧啶和腺嘌呤進行脫氨。Fan等人將該變體用于植物基因編輯，以確認其雙堿基替換的效率，開發了一種稱為TadDE的緊湊型植物雙編輯器。這些DBE增加了單個靶位點內的突變豐度，并可適應更多的應用場景。

源自BEs的精確缺失基因組編輯器利用其功能元件識別并作用于靶位點內的特定堿基，產生可預測的小片段缺失。

2020年，Wang等人建立了一種新的多核苷酸靶向缺失系統，稱為APOBEC-Cas9融合誘導缺失系統(AFID)。作者將野生型SpCas9與胞嘧啶脫氨酶APOBEC、UDG和AP裂合酶結合。該系統基于胞嘧啶脫氨和BER原理，產生從不同5′-胞嘧啶到Cas9切割位點的多核苷酸缺失。研究人員使用截短的APOBEC3B脫氨酶變體(A3Bctd)提高了可預測的缺失效率。隨后，在2022年，Zeng等人通過引入內切核酸酶V(EndoV)，開發了一種基于選擇性切除修復通路的系統，EndoV促進了核酸鏈內3′-肌苷磷酸二酯鍵的水解。作者將EndoV整合到ABE中，并實現了靶位點兩個A之間的精確缺失。

精確缺失基因組編輯器主要通過切割和修復靶位點來發揮作用。這些基因組編輯器可用于分析基因組內的各種調控元件、功能基序和非編碼DNA片段。

對基因編輯工具的更好理解導致了更多CRISPR效應器蛋白的發現，其中一些具有獨特的特性和基本功能。當用作支架蛋白時，小的核酸酶可以有效地減小BEs的尺寸。

目前用于BEs的Cas蛋白包括Cas9（SpCas9-NGG, ScCas9-NNG, SaCas9-NNGRRT, CjCas9-NNNNRYAC）和Cas12蛋白（Cas12a-TTTV, Cas12b-TTTV, Cpf1-TTTV, Cas12j-TTTV, Cas12f-TTN）。這些蛋白拓寬了用于堿基編輯的原間隔序列鄰近基序(PAM)類型范圍，并通過使用Cas12允許減小堿基編輯構建體的尺寸（圖3A）。此外，通過突變負責PAM識別的BUC葉結構域中的關鍵氨基酸，可以擴大靶向范圍。這種方法已成功用于SpCas9變體，包括SpCas9-NG、SpG和SpRY。然而，BEs更廣泛的靶向能力與增加的脫靶率和自我靶向效應相關，需要根據具體的實驗目標仔細選擇Cas蛋白。

BEs依賴于作用于ssDNA的底物堿基特異性修飾酶。這些酶通過脫氨和糖基化選擇和修飾靶位點內的堿基，產生被細胞修復系統識別和修復的非天然堿基中間體。此外，這些酶決定了編輯的目標堿基和編輯窗口，通常分別稱為序列偏好和編輯活性窗口。優化這些酶（包括脫氨酶和糖基化酶）的主要目標是增強其催化活性并改變其底物堿基識別。

機器學習和圖神經網絡的進步為蛋白質和DNA語言模型提供了新的見解，實現了數據驅動的合理蛋白質工程。蛋白質組學數據的分類和進化關系，以及蛋白質結構聚類工具（如Foldseek）的發展，增強了蛋白質的挖掘和修飾。這些技術有助于擴展和優化BE工具箱，促進新支架蛋白的發現并提高其效率，從而增強效應蛋白的性能（圖3B）。

為了增強脫氨酶性能，Thuronyi等人使用了涉及大鼠來源的rAPOBEC和七鰓鰻同源蛋白PmCDA1的PACE和祖先重建系統。該方法產生了高活性突變體，如evorAPOBEC1、evoFERNY和evoCDA1，顯著降低了序列偏好性。Gehrke等人對人胞苷脫氨酶hAPOBEC3A進行了工程化改造，開發了eA3A，在縮小編輯窗口的同時顯著減少了BE3的非預期編輯。在單獨的研究中，Gaudelli等人和Richter等人分別通過直接進化和PACE優化了TadA7.10，產生了具有顯著提高ABE效率的高活性腺嘌呤脫氨酶變體。Yan等人評估了多個TadA變體，并通過組合來自不同變體的突變氨基酸開發了ABE9。Zhang等人通過V28F轉化修飾TadA8e-V106W進行了脫氨酶優化。該方法在將轉錄組脫靶效應降低52倍的同時，提高了靶標編輯效率。此外，TadA來源的胞嘧啶脫氨酶，如CBE6d，與APOBEC1相比，具有更高的編輯效率、更窄的窗口和最小的脫靶效應。

相比之下，大腸桿菌噬菌體輔助蛋白質進化系統的成熟，包括PACE和大腸桿菌正交復制框架，導致了各種堿基編輯工具的創新（圖3B）。因此，合理的蛋白質設計是動植物基因工程以及擴展基因編輯工具箱的基礎。

為了改善糖基化酶性能，Koblan等人評估了各種尿嘧啶修飾酶以用于CGBE開發，揭示了UdgX在動物細胞中的性能優于UNG。Tong等人對MPG酶進行了結構分析和生化表征，實現了DNA相互作用氨基酸的定向突變和篩選。作者產生了高活性的MPGv3，增強了AYBE的編輯效率和產物純度。

除了使用人工突變來增強酶活性外，修飾底物識別已成為擴展BEs應用的一種有前景的策略。Liu及其同事通過將腺嘌呤脫氨酶TadA轉化為胞嘧啶脫氨酶TadA-CD，開創了這種方法。隨后，Yang團隊利用錯配PCR和細菌篩選改變了糖基化酶UNG和MPG的底物堿基，將其靶標堿基從尿嘧啶和次黃嘌呤擴展到其他嘧啶（C和T）和嘌呤（G）組。這導致了gCBE、gTBE和gGBE的開發。

基因編輯工具需要DNA供體，而BEs主要依賴修復通路來產生所需的編輯結果。通過添加相關的蛋白酶來誘導相應的修復通路，可以實現特定的突變。在可用的BE工具中，用于互換任何兩個堿基的基本工具已經成熟，滿足了研究人員對堿基到堿基轉換的要求（圖3C）。這一進展是精準基因組編輯的一個重要里程碑。

胞苷脫氨酶將C轉化為U，U很容易被UNG識別和切除，從而誘導BER通路并產生indel。添加UGI可抑制UNG活性，從而誘導錯配修復并促進C-to-T轉換。與CBE不同，抑制內源性烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)并不會增強ABE的編輯效率或編輯產物的純度，這表明AAG無法有效識別肌苷中間體。該策略消除了額外破壞肌苷損傷修復機制的需要。

相反，增強的MPG活性促進了對I（A脫氨的產物）的識別，產生AP位點。然而，DNA修復方法因物種而異。在玉米中，將ABE與TLS聚合酶融合可通過跨損傷合成促進AP位點修復，產生堿基轉換并減少indel副產物的產生。然而，該策略在水稻中應用時未見顯著改善。

Koblan等人使用細胞DNA修復相關篩選系統來鑒定提高CGBE效率和純度的蛋白質，包括POLD2和RBMX。類似地，Chen等人通過加入BER相關蛋白rXRCC1和rPB（分別是DNA聚合酶β的DNA結合結構域和DNA裂解結構域），提高了C-to-G編輯的效率和純度。

除了底物堿基修飾酶之外，優化編輯系統的其他關鍵組件（包括核定位信號(NLS)和連接子）仍然至關重要（圖3D）。修飾蛋白質的核定位或增加拷貝數可以增強融合蛋白的表達，從而提高編輯效率。Koblan等人用2×雙分型NLS替換SV40 NLS，開發了BE4max和ABEmax，實現了改進的編輯性能。

富含GS的柔性連接子是BEs中常用的連接子；它們的長度影響編輯性能。Komor等人報道，BE3中較長的連接子使脫氨酶能夠更有效地接觸R環內的ssDNA，從而導致均勻的脫氨。相比之下，Xie等人證明將腺嘌呤脫氨酶TadA和Cas9n之間的連接子長度從32個氨基酸減少到16個氨基酸顯著提高了DBE ACBE的效率。

使用功能元件提高BE效率：與噬菌體Mu Gam蛋白融合可通過保護由AP裂合酶引起的DSB并抑制NHEJ修復來降低indel頻率，從而提高CBE產物純度。Zhang等人將多個人類來源的ssDNA結合域(ssDBD/DBD)與CBE融合。與RAD51 DBD融合增強了CBE編輯活性，從而開發了hyBE4max，用于在動物細胞中進行高效的C-to-T替換。該技術實現了高達80%的編輯效率，并將編輯窗口從C4–C8擴展到C4–C12（指示可有效編輯的原間隔序列中胞嘧啶的位置）。Tan等人通過將RAD51 DBD融合到ABE8e，增強了植物中ABE的效率。此外，Zheng等人研究了DBD融合格式對DBE效率的影響，并開發了PhieDBEs，一套高效植物DBE（圖3D）。

使用分裂脫氨酶進行安全編輯(SAFE)以降低脫靶效應：該方法通過將脫氨酶結構域插入nCas9中，將堿基編輯器分裂為其N端和C端部分，從而使脫氨酶和nCas9均失活。最終，該技術阻止了由組成型脫氨酶活性引起的gRNA非依賴性脫靶效應（圖3D）。在靶位點，gRNA作為分子支架將分裂的部分重建為功能齊全的堿基編輯器，從而實現靶向編輯。該方法減少了DNA的gRNA依賴性脫靶編輯和CBE誘導的indel突變產生。類似地，He等人通過將eTDG嵌入nCas9的P1249和E1250