《International Journal of Biological Macromolecules》：A CRISPR/Cas12a-mediated marker-free fluorescent biosensor constructed based on an automated 3D DNA walker-enabled signal amplification for sensitive detection of aflatoxin B1
編輯推薦：
CRISPR/Cas12a介導的3D DNA walker熒光生物傳感器實現了黃曲霉毒素B1的高靈敏度檢測，檢測限達45.38 pg/mL，并成功應用于花生牛奶和飲用水樣本的檢測。
Jingwen Zhang|Biru Han|Xiru Zhang|Xinna Xie|Feng Zhao|Wei Zhang|Yujun Jiang|Xianlong Zhang
教育部乳品科學重點實驗室，東北農業大學食品科學系，哈爾濱，150030，中國
摘要
高效且靈敏地檢測霉菌毒素對于確保食品安全和維護全球公共衛生至關重要。在這項研究中，我們開發了一種基于CRISPR/Cas12a介導的無標記熒光生物傳感器，該傳感器利用自動化的3D DNA步行器實現“一對一多”的信號放大，用于靈敏檢測黃曲霉毒素B1。由于DNA步行器的高效放大作用以及銀納米團簇的強熒光特性，通過精確調控Cas12a對特定目標DNA的切割活性，產生了靈敏的信號輸出。在所建立的熒光生物傳感器中，少量的黃曲霉毒素B1能夠促使3D DNA步行器產生大量的激活劑，從而刺激Cas12a的切割活性，降解DNA單鏈并合成銀納米團簇，導致熒光信號減弱。該生物傳感器在最佳條件下能夠實現黃曲霉毒素B1的靈敏檢測，在0.05至10 ng/mL的線性范圍內檢測限為45.38 pg/mL。此外，該生物傳感器在不同濃度的添加樣品（花生奶和飲用水）中表現出良好的回收率。這項工作為DNA步行器的應用以及基于CRISPR/Cas的無標記熒光傳感平臺的開發提供了新的見解。
引言
根據世界衛生組織的數據，每年約有200萬人因霉菌毒素污染引起的疾病而死亡，這歸因于霉菌毒素的高毒性[1]。在已知的霉菌毒素中，黃曲霉毒素是最具致癌性和毒性的化合物[2]。黃曲霉毒素B1（AFB1）是最常見且毒性最強的黃曲霉毒素亞組，被國際癌癥研究機構明確列為I類致癌物[3]。AFB1具有穩定的化學結構，在加工過程中不易被破壞，并且會隨著時間在食物鏈中積累。攝入后，AFB1會被微粒體混合功能氧化酶代謝，產生多種有毒物質，對公共衛生造成負面影響并導致經濟損失[4]。因此，迫切需要開發一種靈敏可靠的AFB1檢測方法。目前，傳統的霉菌毒素檢測方法（如HPLC和LC-MS）[5]通常存在許多局限性（例如設備昂貴、需要專業操作人員，且不適合快速現場檢測大量樣本），這限制了它們的廣泛應用[6]。因此，開發快速靈敏的檢測技術對于可靠地檢測AFB1至關重要。
近年來，已經開發出用于便攜式和快速檢測AFB1的新技術，包括多種生物傳感平臺（如熒光法、比色法和電化學法）[7]。其中，熒光法因其優勢（如高靈敏度、良好精度、穩定快速響應和操作簡單）[8],[9]而被廣泛使用。作為有效的基因編輯工具，CRISPR/Cas12a在編程的CRISPR RNA（crRNA）的引導下能夠精確識別和切割含有PAM位點的目標DNA[10],[11]。當目標DNA被識別時，Cas12a蛋白的切割活性被激活，在任何單鏈DNA上表現出獨特的切割活性[12],[13]。CRISPR/Cas12a技術非常適合提高熒光生物傳感器的靈敏度，其進步也推動了從核酸到蛋白質等多種目標的分子檢測[14],[15]。然而，在傳統模型中，通常采用“一對一”的模式，即單個目標釋放激活劑來觸發CRISPR/Cas12a反應[16]。為了提高檢測的靈敏度和適應性，CRISPR/Cas12a常與核酸擴增方法結合使用[17]。許多基于DNA的信號放大策略，如分支雜交鏈反應（HCR）和滾環擴增（RCA），表現出出色的信號放大能力[18],[19]。然而，這些與核酸檢測預擴增技術結合的CRISPR/Cas12a方法使檢測變得更加復雜，并可能增加交叉污染的風險[20]。為了解決上述問題，需要另一種合適的信號增強策略。最近，設計了一種名為“3D DNA步行器”的可編程步行器，建議將其與CRISPR/Cas12a結合使用，以利用其優勢（如高度多功能性、適合現場檢測和抗干擾性）[21]。3D DNA步行器是一種基于小型納米顆粒的三維行走概念，由三個部分組成：行走鏈、行走軌道和驅動力。由于內切酶的強催化作用，它常用于實現軌道的自主定向移動[22]。通過DNA步行器的連續移動，只需一個目標就可以觸發數百次循環擴增，從而積累放大信號，為提高檢測靈敏度提供了有利基礎[7]。更重要的是，它適用于轉化各種目標（如小分子、蛋白質和核酸），改善了CRISPR/Cas12a在生物傳感領域的局限性[21]。例如，Zhang等人提出了結合3D DNA步行器和CRISPR/Cas12a的協同作用，提供了一種快速且超靈敏的病原體檢測策略[20]。Guo等人利用DNA步行器和CRISPR/Cas12a策略構建了一種新型超靈敏生物傳感器，用于檢測土霉素[7]。此外，Li等人開發了一種專門的多功能DNA步行器放大的“一對一多”CRISPR/Cas12a介導的熒光生物傳感器，用于超靈敏檢測miRNA-122[21]。然而，據我們所知，目前還沒有將DNA步行器整合到CRISPR/Cas12a介導的AFB1檢測生物傳感器中的研究。
在傳統的基于CRISPR/Cas的熒光生物傳感器中，通常使用熒光團和淬滅劑雙標記的熒光探針來生成檢測信號[23],[24]。盡管這些技術獲得了高靈敏度和廣泛應用，但傳統的熒光探針仍存在一些缺點，如光穩定性差、雙標記使其制造成本高昂且繁瑣[25],[26]。因此，需要開發創新的熒光納米探針。近年來，DNA-AgNCs作為一種無標記熒光探針，在分析和檢測領域引起了廣泛關注，因為它們具有獨特的優勢（如高穩定性、良好的熒光特性和生物相容性）[27]。Ag+可以在DNA的成核區域還原，形成DNA-AgNCs，由于銀的強量子限制效應，這些納米顆粒具有發光特性[28]。此外，靠近富含G的DNA序列可以大大增加DNA-AgNCs的熒光強度，因為電子從鳥嘌呤傳輸到納米顆粒[29]。
在這項研究中，利用CRISPR/Cas12a和DNA步行器技術構建了一種超靈敏的新型適配體生物傳感器，用于檢測AFB1。通過測量DNA-AgNCs在570 nm處的熒光衰減強度來量化AFB1。值得注意的是，所建立的基于適配體的生物傳感器相比常見的適配體生物傳感平臺具有許多優勢，主要包括以下幾點：一方面，通過將DNA步行器與CRISPR/Cas12a結合，巧妙地實現了從單個目標釋放多個激活劑的“一對一多”策略；另一方面，結合了富含G的DNA對DNA-AgNCs的熒光增強作用以及CRISPR/Cas12a的有效切割活性。總之，我們開發了一種創新的工具，能夠方便且超靈敏地檢測特定的霉菌毒素。通過將DNA步行器與CRISPR-Cas12a結合，顯著提高了分析靈敏度，而無標記的DNA-AgNC熒光探針表現出出色的熒光特性。所開發的方法用于分析和檢測AFB1，具有高靈敏度和出色的特異性，并已在實際食品樣本中得到驗證。
材料與設備
DNA標記物、瓊脂糖、SuperRed核酸染料以及DNA探針和引物購自Sangon Biotech有限公司（上海，中國），而crRNA由Genscript Biotech有限公司（南京，中國）生產。所提出方法中使用的所有寡核苷酸列在補充材料（表S1）中。鏈霉親和素功能化的MBs購自Beyotime Biotechnology有限公司（中國）。Cas12a、Nb.BbvCI、Buffer 2.1和rCutSmart Buffer購自New
CRISPR/Cas12a介導的熒光生物傳感平臺原理
所建立的生物傳感器原理包括兩個部分：DNA步行器和CRISPR/Cas12a精確調控的DNA-AgNCs的熒光響應（圖1）。首先，AFB1被適配體特異性識別，少量的AFB1可以通過3D DNA步行器過程釋放大量的激活劑。Cas12a的切割活性被激活，從而切割DNA-AgNCs探針，導致熒光信號減弱。在此過程中，首先在SMBs表面
結論
總之，基于DNA步行器的放大作用以及CRISPR/Cas12a精確調控的DNA-AgNCs觸發的熒光響應，我們構建了一種超靈敏的無標記熒光生物傳感器，用于檢測AFB1。利用Cas12a的特異性識別和獨特的信號轉導特性、適配體的精細識別以及無標記DNA-AgNCs熒光探針的優異熒光特性，該方法具有出色的特異性
CRediT作者貢獻聲明
Jingwen Zhang：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，概念構思。Biru Han：撰寫 – 審稿與編輯。Xiru Zhang：撰寫 – 審稿與編輯。Xinna Xie：撰寫 – 審稿與編輯。Feng Zhao：撰寫 – 審稿與編輯，監督。Wei Zhang：軟件，形式分析。Yujun Jiang：撰寫 – 審稿與編輯，監督。Xianlong Zhang：撰寫 – 審稿與編輯，監督，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
本研究得到了國家自然科學基金（編號：32402229）和東北農業大學的科研啟動資金（編號：54960612）的支持。
