《Biosensors and Bioelectronics》：Dual CRISPR/Cas-driven amplification-free surface-enhanced Raman scattering biosensor combined with a smartphone for simultaneous detection of total and live target bacteria
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CRISPR/Cas12a-Cas13a雙系統SERS生物傳感器實現活菌與總菌同步檢測，靈敏度為~10 CFU/mL，結合手機拉曼設備可在45分鐘內完成現場快速診斷，成功應用于金黃色葡萄球菌和Cronobacter sakazakii檢測。
喬瑞寶|倪群|趙瑞瑞|朱曉凡|王麗霞|焦靜然|江涵|吳倩|姚雙|姚莉|劉凱勇|秦攀珠
中國安徽省桐陵市桐陵人民醫院實驗室醫學部，郵編244000
摘要
同時檢測目標細菌的總數和活菌數量非常重要，但同時也具有挑戰性。為了解決這一挑戰，我們提出了一種基于CRISPR/Cas系統的無擴增表面增強拉曼散射（SERS）生物傳感器，稱為cc-SERS。該生物傳感器的原理在于：細菌死亡后，DNA保持穩定，而某些RNA會迅速降解。簡而言之，活菌中的目標DNA和RNA可以激活CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a，而死菌只能通過目標DNA激活CRISPR/Cas12a。在沒有目標細菌的情況下，CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a都無法被激活。因此，由目標DNA激活的CRISPR/Cas12a產生的特征拉曼信號（1079 cm-1）表明目標細菌的存在（包括死菌和活菌），而由目標RNA激活的CRISPR/Cas13a產生的特征拉曼信號（593 cm-1）表明存在活菌。憑借這種獨特的信號模式，該生物傳感器能夠在單個試管中同時檢測目標細菌的總數和活菌數量，檢測限約為10 CFU/mL。通過引入快速預處理程序和智能手機輔助的便攜式拉曼光譜儀，整個過程可以在現場45分鐘內完成。由于CRISPR/Cas系統的出色可編程性，該生物傳感器已成功應用于金黃色葡萄球菌和Sakazakii克羅諾桿菌的檢測。這項工作為同時檢測目標細菌的總數和活菌數量開辟了一條有前景的途徑。
引言
每年有數億人受到病原菌引起的食品污染和疾病的威脅（Murray等人，2022年；Wang等人，2022年），這對全球公共衛生構成了嚴重威脅。及時篩查傳染性細菌對于保護人們的生命和健康至關重要。目前，金標準培養方法可以提供關于病原菌的詳細信息，但其耗時且勞動密集的特點使得它們無法滿足日益增長的現場檢測需求（Peng等人，2024年；Tozzoli等人，2019年）。雖然替代方法如ELISA（Wang等人，2023年）、側向流動測定（LFA）（Xiong等人，2021年）、qPCR（Zhang等人，2023年）和LAMP（Yan等人，2023年）可以將檢測時間縮短至幾小時甚至幾分鐘，但它們無法提供關于活菌的詳細信息。值得注意的是，在食品污染事件中，活菌往往是真正的感染原因（Wu等人，2024年；Xue等人，2022年）。目標細菌的總數可以反映其初始污染水平，而活菌的數量則表明滅菌后的感染風險（Xie等人，2025年；Zhang等人，2025年）。在臨床實踐中，總細菌計數表明消除前的交叉污染風險，而零活菌計數意味著消毒完成。此外，由活菌或死菌引起的疾病可能需要不同的治療策略。因此，探索能夠同時檢測目標細菌總數和活菌數量的新篩查方法具有重要意義。
迄今為止，已經提出了一些基于細菌代謝物的活菌檢測方法，例如基于ATP的方法（Zheng等人，2025年）和H2S的方法（Gahlaut等人，2019年）。然而，這些方法大多無法識別特定的細菌種類，因為這些代謝物可能存在于不同的細菌中。另一種方法是結合核酸擴增技術和丙胺單氮化物（PMA）（Guo等人，2021年；Lv等人，2020年；Trieu和Lee，2019年）。雖然這種方法具有高靈敏度和特異性，但需要額外的PMA處理時間。此外，復雜食品基質對PMA擴散的限制可能導致假陽性結果。與在活菌和死菌中都保持穩定的基因組DNA不同（Xue等人，2022年），大多數RNA（如mRNA）在細菌死亡后會迅速被環境中的核糖核酸酶降解（Zhuang等人，2024年）。因此，可以通過特定RNA的水平來量化活菌的數量（Zhang等人，2021年）。鑒于此，近年來越來越多的研究致力于開發基于細菌RNA的策略。例如，RT-PCR和RT-LAMP已被證明能有效檢測活菌（Niikura等人，2021年；Yuan等人，2020年）。然而，這些方法需要耗時的純化步驟以避免同源基因組DNA的干擾。此外，非特異性擴增和氣溶膠污染的風險通常是不可避免的（Zhang等人，2021年）。鑒于細菌死亡后DNA保持穩定而某些RNA迅速降解的特性，我們期望構建一種無需擴增的生物傳感器，利用細菌DNA和RNA作為生物標志物來實現目標細菌總數和活菌的數量的同時檢測。
CRISPR/Cas系統是細菌和古菌適應性免疫系統的重要組成部分，能夠特異性識別目標核酸，并在CRISPR RNA（crRNA）的輔助下表現出切割活性（Li等人，2025a；Wang等人，2024a）。通過將CRISPR/Cas系統與電化學（Dong等人，2023年）、表面增強拉曼散射（SERS）（Ma等人，2023年；Zhao等人，2025年）、LFA（Marsic等人，2021年）和微流控技術（Li等人，2024年）結合，已經構建了多種無需擴增且靈敏的生物傳感器。令人鼓舞的是，目標DNA激活的CRISPR/Cas12a系統可以隨機切割單鏈DNA（ssDNA）報告分子，而目標RNA激活的CRISPR/Cas13a系統可以切割單鏈RNA（ssRNA）報告分子（Yin等人，2024年）。此外，現有證據表明這兩種CRISPR/Cas系統可以在同一試管中獨立工作（Gootenberg等人，2018年；Guk等人，2023年；Li等人，2025b；Zhong等人，2025年）。基于以上考慮，我們設想開發一種新型生物傳感器，分別利用CRISPR/Cas12a和Cas13a特異性識別細菌DNA和RNA。
在這項工作中，我們提出了一種基于CRISPR/Cas系統的無擴增SERS生物傳感器（cc-SERS），并結合了智能手機輔助的便攜式拉曼光譜儀，用于同時檢測目標細菌的總數和活菌數量。為了實現雙重SERS檢測，我們使用了（4-氨基硫酚（4-ATP）和Nile blue perchlorate A（NBA）作為信號分子，因為這兩種信號分子之間不存在交叉干擾（Jiang等人，2025年）。用不同信號分子（4-ATP和NBA）修飾的銀殼金納米顆粒（Au@Ag）與硫醇化DNA探針（SH-probe 1和SH-probe 2）結合，形成SERS標簽（Au@Ag-probe4-ATP和Au@Ag-probeNBA）（圖1A）。同時，生物素化的單鏈DNA（bio-ssDNA）和生物素化的單鏈RNA（bio-ssRNA）與鏈霉親和素磁珠（SA-MB）共孵育，制備MB探針（圖1B）。在沒有目標細菌的情況下，失活的CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a無法切割MB探針表面的bio-ssDNA和bio-ssRNA，從而使Au@Ag-probe4-ATP和Au@Ag-probeNBA被MB探針捕獲和分離。因此，在上清液中未檢測到SERS信號（圖1C）。在存在死菌的情況下，目標DNA（T-DNA）激活的CRISPR/Cas12a可以切割MB探針表面的bio-ssDNA。在這種情況下，只有Au@Ag-probeNBA被MB探針捕獲和分離，而Au@Ag-probe4-ATP留在上清液中并產生特征拉曼信號（1079 cm-1）。在存在活菌的情況下，T-DNA激活的CRISPR/Cas12a和T-RNA激活的CRISPR/Cas13a分別切割MB探針表面的bio-ssDNA和bio-ssRNA。這導致Au@Ag-probe4-ATP和Au@Ag-probeNBA都留在上清液中，并在1079 cm-1和593 cm-1處產生特征拉曼信號。由于T-DNA存在于活菌和死菌中，而T-RNA僅存在于活菌中，T-DNA濃度代表活菌和死菌的總數，而T-RNA濃度反映活菌的數量。為了證明cc-SERS的優異性能，我們在下面提供了詳細的證明。
材料與試劑
四水合氯金酸（HAuCl4?4H2O）購自Sigma-Aldrich。基因組DNA提取試劑盒、細菌總RNA純化試劑盒、一步提取緩沖液、檸檬酸鈉（Na3Cit）、L-抗壞血酸、T7 RNA聚合酶、dNTP混合物（25 mM）、NTP混合物（25 mM）、DNase I和PEG 20000購自Sangon Biotech（中國上海）。NBA購自BoMei Biotech（中國合肥）。4-ATP由Macklin Biochemical（中國上海）提供。Cas12a蛋白...
雙重CRISPR/Cas驅動的金黃色葡萄球菌總數和活菌同時檢測的驗證
為了驗證雙重CRISPR/Cas驅動的熒光測定法是否可用于同時檢測目標細菌的總數和活菌數量（圖1A），分別設計了針對金黃色葡萄球菌的femA基因的CRISPR/Cas12a系統和針對femA基因mRNA的CRISPR/Cas13a系統（表S1）。使用ssDNA報告分子（FAM/BHQ1，λem= 520 nm）和ssRNA報告分子（Cy3/BHQ2，λem= 570 nm），參考了之前的研究（Guk等人，2023年）。正如預期的那樣...
結論
總結來說，我們開發了一種基于CRISPR/Cas系統的無擴增SERS生物傳感器（稱為cc-SERS）。該生物傳感器能夠同時檢測目標細菌的總數和活菌數量，這是傳統培養方法、qPCR方法和大多數現有生物傳感器無法實現的。該生物傳感器消除了額外的預擴增步驟的需求，操作簡單，從而避免了對熱循環儀的依賴。該生物傳感器已成功用于金黃色葡萄球菌的檢測。
CRediT作者貢獻聲明
倪群：撰寫——原始草稿、可視化、方法學、數據分析、調查、驗證。趙瑞瑞：驗證、監督、方法學、數據分析。朱曉凡：驗證、調查、數據分析、可視化。王麗霞：資源獲取、調查。劉凱勇：撰寫——審閱與編輯、可視化、驗證、方法學、資金獲取。秦攀珠：撰寫——審閱與編輯、撰寫——原始草稿、可視化利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
致謝
本工作得到了國家重點研發計劃（2022YFF1102900）、安徽省自然科學基金（2308085QC112）、安徽省臨床醫學研究轉化專項基金（202427b10020076）、安徽醫科大學的科學研究水平提升計劃（2022xkjT007）以及安徽醫科大學公共衛生學院的Eagle計劃指導團隊的支持。
