《Cancer Gene Therapy》：Effective delivery of genome editor to cervical cancer targeting Mcl1 for cancer therapy
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本研究針對CRISPR/Cas9系統在體內遞送效率低和脫靶風險高等挑戰，開發了一種基于Lamp2b-PhoCl蛋白分選系統的人工細胞外囊泡(EVs)遞送平臺。研究人員成功將Cas9-sgMcl1核糖核蛋白(RNP)封裝入人工EVs中，證實其可有效抑制宮頸癌細胞增殖、遷移并誘導細胞凋亡。動物實驗表明，EVsRNP(Cas9-Mcl1)能顯著抑制宮頸癌移植瘤生長，為基因編輯工具的靶向遞送提供了新思路。
CRISPR/Cas9基因編輯技術作為精準醫療領域的革命性突破，為遺傳性疾病和癌癥治療帶來了前所未有的希望。然而，如何將這一強大的分子剪刀安全高效地遞送到靶細胞內部，始終是制約其臨床應用的瓶頸問題。傳統的病毒載體雖然轉染效率較高，但存在插入突變和免疫原性等風險；而非病毒遞送系統又往往面臨遞送效率不足的挑戰。特別是在宮頸癌治療領域，開發一種能夠精準遞送基因編輯工具且兼具安全性的遞送平臺顯得尤為迫切。
在這項發表于《Cancer Gene Therapy》的研究中，研究人員將目光投向了天然存在的細胞間通訊載體——細胞外囊泡。這些由細胞分泌的納米級脂質雙層結構，天生具有優異的生物相容性和低免疫原性。研究團隊創新性地構建了一種人工細胞外囊泡遞送系統，通過基因工程手段將靶向抗凋亡蛋白Mcl1的CRISPR/Cas9核糖核蛋白復合物封裝其中，為實現宮頸癌的精準基因治療提供了新策略。
研究的關鍵創新點在于設計了獨特的蛋白分選系統。該團隊構建了含有Lamp2b跨膜結構域、光裂解蛋白PhoCl和Cas9蛋白的融合表達載體，利用細胞自身的外泌體生物合成途徑，將Cas9核糖核蛋白定向裝載到細胞外囊泡中。當這些工程化囊泡被宮頸癌細胞攝取后，在特定光照條件下，PhoCl蛋白發生裂解，從而釋放出具有生物活性的Cas9-sgMcl1復合物，實現對Mcl1基因的特異性編輯。
主要技術方法包括：質粒構建與細胞轉染技術、超速離心分離細胞外囊泡、透射電子顯微鏡和納米顆粒跟蹤分析用于囊泡表征、Western blot檢測蛋白表達、流式細胞術分析細胞凋亡和GFP陽性率、Transwell實驗評估細胞遷移、異種移植瘤模型評估體內療效、免疫組化分析Mcl1蛋白表達、Sanger測序驗證基因編輯效率。研究使用了TCGA數據庫和臨床樣本進行生物信息學分析，所有患者樣本均獲得倫理委員會批準。
Mcl1在宮頸癌中的表達水平
通過分析TCGA數據集和臨床樣本發現，Mcl1在宮頸癌組織中的mRNA和蛋白表達水平顯著高于非癌組織。生存分析顯示Mcl1高表達患者預后較差，表明Mcl1是宮頸癌治療的潛在靶點。免疫組化和qPCR結果進一步驗證了這一發現。
生物工程化人工EVs的裝載策略及表征
研究人員成功構建了"Lamp2b-PhoCl-Cas9"質粒，通過細胞轉染和超速離心獲得了裝載Cas9-sgMcl1 RNP的人工EVs。透射電鏡顯示典型的杯狀結構，納米顆粒跟蹤分析表明粒徑范圍為30-1000nm。Western blot證實EVs表達CD63、Alix、Tsg101等經典標志物，同時檢測到Lamp2b和Cas9蛋白的成功裝載。
人工EVs被受體細胞攝取的過程
PKH26標記實驗顯示EVs可被HeLa細胞有效內化。表達GFP的EVsGFP處理組在細胞內檢測到明顯的綠色熒光，而PBS和空白EVs對照組無熒光信號。EVsnanoLuc實驗進一步證實了EVs遞送功能的劑量依賴性。
人工EVsRNP(Cas9-sgMcl1)在體外抑制宮頸癌細胞增殖和遷移
功能實驗表明，與對照組相比，EVsRNP(Cas9-sgMcl1)處理顯著抑制HeLa細胞遷移能力和活力。Sanger測序檢測到Mcl1基因位點出現特異性插入缺失突變，Western blot顯示Mcl1蛋白表達下降。流式細胞術檢測發現實驗組細胞凋亡率顯著增加。
EVsRNP(Cas9-sgMcl1)在體內抑制宮頸癌異種移植瘤模型
在荷瘤裸鼠模型中，尾靜脈注射EVsRNP(Cas9-sgMcl1)顯著抑制腫瘤生長，而體重無顯著變化。免疫組化顯示腫瘤組織Mcl1蛋白表達降低，基因測序證實體內編輯效率。
EVs的靶向策略
通過生物素-鏈霉親和素系統構建靶向Her2的EVsGFP，證實可特異性增加Her2陽性細胞的攝取率，而未修飾EVs無此效果，表明表面修飾可增強EVs的靶向性。
EVsRNP的體內分布和安全性
體內分布實驗顯示EVs主要在肝臟和腫瘤中富集。值得注意的是，雖然在肝細胞中檢測到GFP信號，但僅在腫瘤細胞中檢測到基因編輯事件，推測與腫瘤細胞增殖活躍、更易發生CRISPR/Cas9介導的基因編輯有關。
該研究成功構建了一種基于人工細胞外囊泡的CRISPR/Cas9遞送平臺，實現了對宮頸癌關鍵靶點Mcl1的高效基因編輯。研究不僅證實了該遞送系統在體外和體內的抗腫瘤效果，還揭示了其相對于傳統遞送方法的獨特優勢：一方面利用EVs的天然生物相容性降低免疫原性，另一方面通過內源性裝載策略提高遞送效率。特別值得關注的是，研究發現該遞送系統在體內表現出一定的腫瘤選擇性，雖然在正常組織中有分布，但基因編輯主要發生在增殖活躍的腫瘤細胞中，這為降低脫靶效應提供了重要保障。
研究的局限性在于尚未系統評估不同 cargo（如化療藥物、mRNA等）的共遞送效果，以及表面修飾策略對靶向性的優化空間。此外，脫靶效應的全面評估仍需借助GUIDE-seq等高通量測序技術進一步驗證。盡管如此，這項工作為基因編輯工具的臨床轉化提供了創新性解決方案，不僅為宮頸癌治療開辟了新途徑，也為其他遺傳性疾病和癌癥的基因治療奠定了技術基礎。隨著遞送效率的不斷提升和安全性評價體系的完善，人工細胞外囊泡有望成為下一代基因治療遞送系統的重要候選。
