《Cell Genomics》：CRISPR activation screens map the genomic landscape of cancer glycome remodeling
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本研究針對癌癥細(xì)胞通過表面聚糖重塑逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制尚不明確的問題，利用CRISPR激活篩選技術(shù)系統(tǒng)性鑒定調(diào)控Siglec配l體表達(dá)的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)ST3GAL家族唾液酸轉(zhuǎn)移酶及GAL3ST4等磺基轉(zhuǎn)移酶是驅(qū)動Siglec-7/9/10配體表達(dá)的核心因子，并揭示CD44、CSPG4等蛋白可作為“專職配體”增強(qiáng)Siglec結(jié)合。該研究構(gòu)建了迄今最全面的癌癥相關(guān)糖基化調(diào)控圖譜，為開發(fā)靶向Glyco-免疫檢查點的療法提供了新靶點。
癌癥細(xì)胞能夠通過改變細(xì)胞表面的糖分子修飾來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，這一過程被稱為“糖組重塑”。特別值得注意的是，癌細(xì)胞會大量增加一種名為唾液酸的糖分子在細(xì)胞表面的表達(dá)。這些唾液酸能夠與免疫細(xì)胞表面的Siglec受體結(jié)合，進(jìn)而抑制免疫細(xì)胞的活性，相當(dāng)于給免疫細(xì)胞上了“剎車”。然而，科學(xué)家們對于癌細(xì)胞是如何精確調(diào)控這一復(fù)雜過程的遺傳基礎(chǔ)仍知之甚少。哪些基因的異常表達(dá)導(dǎo)致了這些免疫抑制性糖配體的產(chǎn)生？是否存在某些關(guān)鍵的“開關(guān)”基因？回答這些問題對于開發(fā)新的癌癥免疫療法至關(guān)重要。
為了系統(tǒng)性地回答這些問題，研究人員在《Cell Genomics》上發(fā)表了他們的最新研究成果。他們采用了一種強(qiáng)大的功能基因組學(xué)工具——CRISPR激活篩選技術(shù)。這項技術(shù)不同于傳統(tǒng)的基因敲除，它能夠高效地過表達(dá)人類基因組中的每一個基因。研究團(tuán)隊構(gòu)建了攜帶CRISPR激活系統(tǒng)的K-562白血病細(xì)胞模型，并利用覆蓋全基因組的sgRNA文庫，使細(xì)胞群體中的每個基因都有機(jī)會被單獨激活。隨后，他們使用分別結(jié)合Siglec-7、Siglec-9和Siglec-10的Fc融合蛋白來檢測細(xì)胞表面相應(yīng)配體的表達(dá)水平。通過流式細(xì)胞分選技術(shù)，他們將配體表達(dá)最高和最低的細(xì)胞群體分選出來，并通過測序分析哪些基因的激活會導(dǎo)致Siglec配體表達(dá)的增加或減少。
關(guān)鍵技術(shù)方法概覽
本研究的關(guān)鍵技術(shù)方法包括：1）基于CRISPR/dCas9的基因組尺度激活篩選技術(shù)，用于系統(tǒng)性發(fā)現(xiàn)調(diào)控Siglec-Fc結(jié)合的基因；2）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Fc嵌合蛋白染色，用于定量檢測細(xì)胞表面Siglec配體的表達(dá)水平；3）CasTLE生物信息學(xué)分析流程，用于統(tǒng)計鑒定顯著性調(diào)控基因；4）針對特定基因的CRISPR/Cas9基因敲除驗證實驗；5）利用癌癥基因組圖譜公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性分析。研究所用細(xì)胞系包括K-562、OCI-AML-2、LN-229等，部分臨床相關(guān)性分析基于TCGA中的低級別膠質(zhì)瘤患者隊列數(shù)據(jù)。
研究結(jié)果
基因組尺度CRISPRa篩選系統(tǒng)繪制Siglec配體表達(dá)調(diào)控圖譜
研究人員通過三輪獨立的篩選，分別繪制了調(diào)控Siglec-7、-9和-10配體表達(dá)的基因圖譜。結(jié)果顯示，唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族是最強(qiáng)的正調(diào)控因子。其中，ST3GAL家族成員對Siglec-7配體表達(dá)促進(jìn)作用尤為顯著，而ST6GAL1的激活則特異性增強(qiáng)Siglec-10的結(jié)合。有趣的是，篩選結(jié)果揭示了唾液酰化與GlcNAc基化途徑之間的“生物合成競爭”關(guān)系，例如GCNT1、B3GNT3等基因的過表達(dá)會拮抗Siglec配體的形成。此外，研究還鑒定出CD44、CSPG4、LRRC15等多個細(xì)胞表面蛋白作為潛在的Siglec“專職配體”。
不同Siglec受體對聚糖類型表現(xiàn)出選擇性結(jié)合特性
深入研究后發(fā)現(xiàn)，不同Siglec受體對聚糖類型具有明顯的選擇性。Siglec-7的配體表達(dá)主要受O-聚糖唾液�；刚{(diào)控，而Siglec-10則更傾向于結(jié)合N-連接聚糖。令人意外的是，曾被廣泛報道為Siglec-10配體的CD24，在本研究的模型體系中并未顯示出調(diào)控作用。相反，CSPG4和CD44被確認(rèn)為新型的Siglec-9高親和力配體。這些發(fā)現(xiàn)提示，不同的Siglec受體可能通過識別不同類型的糖蛋白和糖鏈結(jié)構(gòu)來行使免疫調(diào)節(jié)功能。
磺基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST4是膠質(zhì)瘤中Siglec-7配體表達(dá)的關(guān)鍵驅(qū)動因子
通過對篩選結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)挖掘，研究人員發(fā)現(xiàn)磺基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST4在低級別膠質(zhì)瘤中是一個顯著的不良預(yù)后因子。實驗驗證表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN-229中敲低GAL3ST4可顯著降低Siglec-7-Fc的結(jié)合，而回補(bǔ)實驗則能恢復(fù)結(jié)合能力。進(jìn)一步酶處理實驗提示，Siglec-7可能結(jié)合一種新型的“3-磺酸-6-唾液酸核心1”O(jiān)-聚糖結(jié)構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了GAL3ST4是膠質(zhì)瘤免疫逃逸的新驅(qū)動因子，也拓展了人們對Siglec-7配體結(jié)構(gòu)多樣性的認(rèn)識。
研究結(jié)論與意義
本研究通過大規(guī)模的CRISPR激活篩選，首次構(gòu)建了癌癥細(xì)胞Siglec配體表達(dá)的全局性遺傳調(diào)控圖譜。該圖譜揭示了不同Siglec受體配體表達(dá)的復(fù)雜性和特異性，強(qiáng)調(diào)了唾液�；c其它糖基化修飾途徑之間的精細(xì)平衡在調(diào)控免疫檢查點中的核心作用。研究鑒定出的關(guān)鍵調(diào)控基因，如ST3GALs、GAL3ST4等，以及新型配體蛋白，如CD44、CSPG4，為開發(fā)靶向Glyco-免疫檢查點的療法提供了豐富的候選靶點。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)不同的癌癥類型可能利用不同的遺傳途徑來實現(xiàn)糖組重塑和免疫逃逸，這意味著未來的治療策略可能需要根據(jù)腫瘤的特定糖基化譜進(jìn)行個性化設(shè)計。這項研究極大地深化了我們對癌癥糖免疫學(xué)的理解，為下一代免疫療法的開發(fā)奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。
