經(jīng)過硅烷處理的鈣鈦礦光電化學(xué)發(fā)光（ECL）材料：在CsPbBr?@SiO?@Au體系中，通過Cas13a蛋白觸發(fā)信號(hào)增強(qiáng)型傳感功能
《Bioelectrochemistry》：Silica-detoxified perovskite ECL: Cas13a-triggered signal-on sensing with CsPbBr?@SiO?@Au
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通過整合CsPbBr?@SiO?@Au納米復(fù)合材料與CRISPR/Cas13a-Nb.BbvI遞增放大系統(tǒng)，構(gòu)建了具有優(yōu)異水穩(wěn)定性和低毒性的信號(hào)-on電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了ultrasonic miRNA檢測(cè)靈敏度達(dá)1.86 aM。納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)（SiO?殼層增強(qiáng)穩(wěn)定性/Au納米顆粒提供錨定位點(diǎn)）與CRISPR遞歸放大（Cas13a切割觸發(fā)Nb.BbvI循環(huán)回收探針）協(xié)同作用，確保了高特異性（區(qū)分同源序列）和線性范圍廣（1 aM-1×10? aM）。經(jīng)血清驗(yàn)證，回收率95.22%-104.61%（RSD<5%），并成功區(qū)分患者與健康人群樣本，為核酸液體活檢提供新平臺(tái)。
Kangqi Xie|Haozhen Ren|Dingpeng Ban|Luchang Chen|Xudong Xin|Jiayi Zhang|Qianli Tang|Longjian Huang|Jihua Wei|Kai Zhang|Xianjiu Liao
中國(guó)廣西百色右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西骨與關(guān)節(jié)退行性疾病臨床前與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，533000
摘要
鈣鈦礦納米晶體是具有吸引力的電化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)射體，但存在水穩(wěn)定性差和潛在毒性的問題。本文報(bào)道了一種信號(hào)激活型電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，該傳感器將CsPbBr?@SiO?@Au納米復(fù)合材料與CRISPR/Cas13a–Nb.BbvCI擴(kuò)增級(jí)聯(lián)系統(tǒng)結(jié)合，用于超靈敏的microRNA檢測(cè)。CsPbBr?核心提供明亮的發(fā)光，SiO?殼層增強(qiáng)了水相兼容性并抑制了離子泄漏，表面的Au納米粒子為硫醇化的鐵芬環(huán)（Fc-HP）提供了豐富的固定位點(diǎn)。在靜止?fàn)顟B(tài)下，近端的Fc能夠有效淬滅CsPbBr?的ECL信號(hào)。目標(biāo)miRNA激活Cas13a，使其切割啞鈴形探針并釋放出能與Fc-HP雜交的中間片段；隨后的Nb.BbvCI切割將Fc從電極上移除并實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的信號(hào)恢復(fù)。通過形態(tài)學(xué)（TEM）、成分分析（EDS/XPS）和階梯式電化學(xué)（CV/EIS）驗(yàn)證了這種核殼-Au結(jié)構(gòu)以及預(yù)期的淬滅→恢復(fù)行為。在優(yōu)化條件下（0.5 mg/mL CsPbBr?@SiO?@Au、2.0 μM Fc-HP、40分鐘目標(biāo)孵育、100 mM TPrA、120秒預(yù)反應(yīng)），該傳感器的檢測(cè)范圍為1 aM–1.0 × 10^9 aM，檢測(cè)限（LOD）為1.86 aM。該傳感器對(duì)同源序列具有高特異性，在添加了miRNA的血清樣本中可實(shí)現(xiàn)95.22%–104.61%的回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）< 5%。初步實(shí)驗(yàn)表明該傳感器能夠區(qū)分患者血清樣本和健康對(duì)照組，顯示出臨床應(yīng)用潛力。這一模塊化平臺(tái)將穩(wěn)定的鈣鈦礦ECL發(fā)射與可編程的CRISPR技術(shù)相結(jié)合，為microRNA分析提供了一種靈敏、選擇性強(qiáng)且兼容水相的檢測(cè)方法。
引言
電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感作為一種靈敏且對(duì)設(shè)備要求低的核酸液體生物檢測(cè)方法，因其低光學(xué)背景、高表面可控性和易于與酶促擴(kuò)增結(jié)合而受到關(guān)注[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。金屬鹵化物鈣鈦礦，尤其是CsPbBr?納米晶體，由于其高輻射效率和快速的電荷傳輸能力而成為優(yōu)秀的ECL發(fā)射體[8]。然而，鈣鈦礦在生物介質(zhì)中的應(yīng)用長(zhǎng)期受到其較差的水穩(wěn)定性和Pb^2+泄漏安全問題的限制。通過將鈣鈦礦核心嵌入超薄、致密的SiO?殼層（CsPbBr?@SiO?）中，可以顯著提高其水相兼容性：二氧化硅屏障抑制了離子遷移和表面陷阱態(tài)，減少了在潮濕或水環(huán)境中的溶解，并降低了Pb釋放的風(fēng)險(xiǎn)[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。因此，這種復(fù)合材料在緩沖的生物檢測(cè)環(huán)境中表現(xiàn)出更好的分散性和操作穩(wěn)定性，使其作為可靠的ECL傳感器使用，同時(shí)降低了相對(duì)于純鈣鈦礦的毒性風(fēng)險(xiǎn)。
從功能上看，SiO?殼層還提供了一個(gè)化學(xué)惰性、生物相容性的界面，能夠耐受電解質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸。在外表面涂覆Au納米粒子（CsPbBr?@SiO?@Au）后，通過Au-硫醇化學(xué)作用形成了密集且定義明確的固定位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)量的硫醇化DNA探針固定，而不會(huì)使發(fā)光核心失活。這種結(jié)構(gòu)支持基于距離控制的ECL淬滅/恢復(fù)機(jī)制：組裝在Au層上的鐵芬環(huán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Fc-HP）靠近發(fā)光體，能夠在靜止?fàn)顟B(tài)下淬滅ECL信號(hào)，從而設(shè)定一個(gè)較低的基線水平[14]、[15]。
CRISPR/Cas13a是一種針對(duì)RNA目標(biāo)設(shè)計(jì)的互補(bǔ)分子工具。Cas13a是一種RNA引導(dǎo)的RNase，當(dāng)目標(biāo)RNA與其CRISPR RNA（crRNA）雜交時(shí)，它會(huì)從序列特異性的內(nèi)切酶轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N強(qiáng)大的“旁路”核酸酶，無差別地切割附近的單鏈RNA[16]、[17]、[18]。這一特性使得無需逆轉(zhuǎn)錄或聚合酶即可實(shí)現(xiàn)“等溫”的酶促信號(hào)放大，非常適合檢測(cè)如miRNA這樣的短生物標(biāo)志物。實(shí)際應(yīng)用中，crRNA間隔區(qū)（通常根據(jù)目標(biāo)序列長(zhǎng)度為24–28 nt）被設(shè)計(jì)為與目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)單核苷酸錯(cuò)配的區(qū)分；合成的富含rU的報(bào)告分子（或嵌入探針中的rU環(huán)段）可作為高效的旁路底物[19]、[20]、[21]。Cas13a在溫和的Mg^2+緩沖液和接近生理溫度的條件下運(yùn)行，并且在使用RNase抑制劑和簡(jiǎn)單阻斷策略的情況下能夠耐受復(fù)雜的生物基質(zhì)。當(dāng)與切割內(nèi)切酶結(jié)合使用時(shí)，目標(biāo)激活的旁路切割可以轉(zhuǎn)化為探針的循環(huán)利用，使每個(gè)目標(biāo)RNA事件觸發(fā)多次表面反應(yīng)，從而大幅增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度——這與ECL傳感器的特性非常匹配，因?yàn)榻藰?biāo)記的去除直接恢復(fù)了鈣鈦礦的天然發(fā)光。
為了賦予分子特異性和信號(hào)增強(qiáng)效果，我們將CRISPR/Cas13a驅(qū)動(dòng)的酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)與啞鈴形探針（DBP）和切割內(nèi)切酶Nb.BbvCI結(jié)合。血清中的目標(biāo)miRNA與Cas13a–crRNA復(fù)合物結(jié)合，激活Cas13a對(duì)DBP中富含rU的環(huán)段進(jìn)行切割，破壞啞鈴結(jié)構(gòu)并釋放DNA中間片段。該中間片段與表面結(jié)合的Fc-HP雜交形成Nb.BbvCI識(shí)別位點(diǎn)；隨后Nb.BbvCI切割將Fc標(biāo)記的片段從電極上移除，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的恢復(fù)。重要的是，釋放的中間片段會(huì)重新進(jìn)入循環(huán)，持續(xù)處理更多的Fc-HP分子，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的循環(huán)利用和顯著信號(hào)放大。所提出的傳感器結(jié)合了（i）適合生物介質(zhì)的、低毒性的鈣鈦礦ECL平臺(tái)（CsPbBr?@SiO?@Au）；（ii）Cas13a的可編程RNA識(shí)別和切割能力；以及（iii）通過切割輔助的循環(huán)利用機(jī)制，將單個(gè)miRNA事件轉(zhuǎn)化為強(qiáng)烈的ECL信號(hào)。
化學(xué)物質(zhì)和試劑
溴化銫（CsBr）、溴化鉛（PbBr?）、1-十八烯（ODE）、油酸（OA）、油胺（OAm）、甲苯、己烷、乙醇、丙酮、環(huán)己烷和氫氧化銨（28–30%）均為分析級(jí)純度（≥99%）。四乙基正硅酸鹽（TEOS）、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷（MPTS）、四氯化金(III)三水合物（HAuCl?·3H?O）、檸檬酸鈉、硼氫化鈉（NaBH?）、6-巰基-1-己醇（MCH）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）等。所提出的ECL生物傳感器原理
所提出的電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器的工作原理如圖1所示。如圖1A所示，首先通過用CsPbBr?@SiO?@Au納米復(fù)合材料修飾玻璃碳電極（GCE）來制備傳感界面。在這種結(jié)構(gòu)中，CsPbBr?鈣鈦礦核心作為高效的發(fā)光體，SiO?殼層提高了水穩(wěn)定性并降低了鈣鈦礦的固有毒性，表面的Au納米粒子（AuNPs）進(jìn)一步增強(qiáng)了傳感性能。結(jié)論
我們建立了一種信號(hào)激活型電化學(xué)發(fā)光生物傳感策略，該策略將水穩(wěn)定性高、低毒性的CsPbBr?@SiO?@Au納米復(fù)合材料與CRISPR/Cas13a旁路切割和Nb.BbvCI輔助循環(huán)利用相結(jié)合。SiO?殼層顯著提高了鈣鈦礦發(fā)光體的水相穩(wěn)定性，并降低了其固有的毒性；Au表面為硫醇化發(fā)夾探針提供了穩(wěn)定的固定位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了高效的淬滅→恢復(fù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Kangqi Xie：撰寫 – 審稿與編輯、原始草稿撰寫、項(xiàng)目監(jiān)督、軟件開發(fā)、方法學(xué)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析。Haozhen Ren：驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、軟件開發(fā)、項(xiàng)目管理、方法學(xué)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析。Dingpeng Ban：數(shù)據(jù)可視化、結(jié)果驗(yàn)證、軟件應(yīng)用、資源協(xié)調(diào)、研究實(shí)施、資金獲取、數(shù)據(jù)管理。Luchang Chen：結(jié)果驗(yàn)證、資源調(diào)配、項(xiàng)目管理、方法學(xué)設(shè)計(jì)、資金獲取、數(shù)據(jù)分析。Xudong Xin：利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財(cái)務(wù)利益沖突或個(gè)人關(guān)系可能影響本文的研究結(jié)果。致謝
我們衷心感謝以下機(jī)構(gòu)的財(cái)政支持：國(guó)家自然科學(xué)基金（82260532）、廣西自然科學(xué)基金（2025GXNSFHA069115）、生命科學(xué)分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（SKLACLS2314）、廣西骨與關(guān)節(jié)退行性疾病基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（21-220-06-202205）、百色生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)與臨床分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2022-38-05）。
