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這篇綜述系統闡述了液滴數字CRISPR（ddCRISPR）技術如何將CRISPR系統的高序列特異性與液滴數字微流控的絕對定量能力相結合，為核酸檢測提供了高靈敏度、高精密度和高通量的解決方案。文章詳細介紹了ddCRISPR的核心原理、工作流程（包括液滴生成、操控與檢測）、信號檢測策略（涵蓋無擴增和等溫擴增輔助方法），并重點討論了其在病毒（如HPV、SARS-CoV-2）、細菌及其他DNA/RNA生物標志物檢測中的代表性應用。同時，綜述也分析了當前面臨的挑戰（如工作流程自動化、液滴穩定性、多重檢測）和未來展望（如人工智能輔助分析、床旁檢測集成），旨在推動該技術從實驗室研究向穩健、可擴展的診斷方案轉化。
液滴數字CRISPR（ddCRISPR）技術原理與工作流程
ddCRISPR技術是一種創新的核酸檢測平臺，它巧妙地將CRISPR-Cas系統的可編程、序列特異性識別能力與液滴數字微流控技術的絕對定量優勢相結合。其核心在于將樣品分割成數千至數百萬個皮升級的微液滴，每個液滴作為一個獨立的微反應器。當目標核酸分子被隨機分配至這些液滴中時，遵循泊松（Poisson）分布原理。在含有目標分子的液滴（陽性液滴）中，CRISPR-Cas系統（如Cas12a、Cas13a）被激活，并發揮其“附帶切割”活性，切割報告分子（如帶有淬滅基團的單鏈DNA或RNA熒光探針），從而產生熒光信號。而不含目標分子的液滴（陰性液滴）則無熒光信號。通過統計陽性液滴的比例，即可根據泊松統計公式（λ = -ln(1 - p)，其中p為陽性液滴比例，λ為每個液滴中的平均目標分子數）實現對待測核酸的絕對定量，無需依賴標準曲線。這種數字化計數方式顯著提高了檢測的靈敏度（可達單分子水平）和精密度，并有效降低了復雜樣本中抑制物的干擾。
液滴的生成、操控與檢測是ddCRISPR工作流程的關鍵環節。液滴生成策略主要分為被動式（如流動聚焦、T型結、共流、階躍乳化）和主動式（如電控、聲表面波、機械振動）。生成單分散性高、尺寸均一的液滴對于保證定量準確性至關重要。液滴生成后，可能需要進行混合、融合、注入（如皮升注射）或分裂等操控步驟，以實現試劑的均勻混合、控制反應時序或執行多步反應，這對于提高檢測的同步性和降低背景信號具有重要意義。最終，通過光學熒光檢測、激光誘導熒光檢測（如熒光激活液滴分選FADS）或電學檢測等方法對每個液滴的熒光信號進行讀取，區分陽性與陰性液滴，完成數字化定量。
信號檢測策略：無擴增與等溫擴增輔助ddCRISPR
ddCRISPR的信號檢測策略主要分為無擴增和等溫擴增輔助兩大類。
無擴增ddCRISPR策略直接依賴于液滴內單分子目標核酸激活CRISPR-Cas系統所產生的信號。其優勢在于流程簡單、速度快、避免了擴增帶來的污染風險和非特異性問題。當單個目標分子被限制在皮升級液滴中時，其局部濃度足以激活Cas酶，單個激活的Cas酶可切割超過104個報告分子，產生強烈的局部熒光爆發，從而實現單分子檢測。該策略在檢測微小RNA（miRNA）等短片段核酸時顯示出獨特優勢。
然而，對于極低濃度的目標物，通常需要借助等溫擴增技術來預放大目標核酸，再將擴增產物與CRISPR檢測系統結合，即擴增輔助ddCRISPR策略。常用的等溫擴增方法包括：
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環介導等溫擴增（LAMP）：使用4-6條引物，在60-65°C下高效擴增，產生復雜的莖環結構DNA產物。LAMP-ddCRISPR靈敏度高，但引物設計復雜，存在非特異性擴增風險。
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重組酶聚合酶擴增（RPA/RAA）：利用重組酶-引物復合物在37-42°C常溫下進行擴增，反應快速（5-20分鐘），對設備要求低，更適合現場檢測。RPA/RAA與ddCRISPR聯用，在液滴分隔環境下可減少引物二聚體等非特異性擴增。
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滾環擴增（RCA）：基于環狀模板進行線性擴增，產生長的串聯重復序列，為Cas酶提供多個識別位點，有助于信號放大。特別適用于miRNA或短DNA片段檢測。
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超分支滾環擴增（HCA）：產生高度分支的DNA結構，實現指數級信號放大。
擴增輔助策略雖然提高了靈敏度，但也增加了檢測的復雜性和時間，以及交叉污染的可能性。選擇無擴增還是擴增輔助策略需根據檢測靈敏度、速度、樣本類型和實際應用場景的需求權衡。
ddCRISPR在核酸生物標志物檢測中的應用
ddCRISPR技術已在多種核酸生物標志物的檢測中展現出巨大潛力，應用范圍覆蓋DNA和RNA靶標。
DNA生物標志物檢測
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人乳頭瘤病毒（HPV）DNA：HPV感染是宮頸癌等疾病的主要誘因。ddCRISPR平臺如PADLOCK-CRISPR（結合RPA預擴增和Cas13a檢測）、d3CRISPR（無擴增Cas12a檢測）等，已成功用于HPV16/18等亞型的絕對定量，檢測限低至1-5拷貝/微升，與qPCR結果高度一致，在臨床樣本檢測中表現出色。
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其他病毒DNA：針對JC病毒（JCV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、 Epstein-Barr病毒（EBV）、乙型肝炎病毒（HBV）等的ddCRISPR檢測方法也被開發出來。例如，結合RPA的數字化CRISPR/Cas13a平臺（MdCaR）檢測JCV DNA的靈敏度比qPCR高100倍。無擴增液滴Cas12a檢測可定量ASFV、EBV、HBV等。
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致病菌DNA：在食品安全和臨床診斷中，ddCRISPR用于檢測如沙門氏菌（靶向invA基因）、大腸桿菌、李斯特菌等病原菌。例如，DropCRISPR平臺結合LAMP與Cas12a，可在復雜基質（如生牛奶）中檢測低至102CFU/mL的活菌。多重ddCRISPR檢測能同時鑒定多種病原體。
RNA生物標志物檢測
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SARS-CoV-2 RNA：在COVID-19疫情期間，ddCRISPR被廣泛應用于SARS-CoV-2 RNA的檢測。策略包括RT-LAMP結合Cas12b的ddRECD平臺、RT-RAA結合Cas12a的平臺等，均實現了高靈敏度和定量檢測。無擴增的ultralocalized Cas13a平臺甚至可在15分鐘內實現單分子水平的SARS-CoV-2 RNA檢測。
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其他病毒RNA：如甲型流感病毒、發熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）、寨卡病毒（ZIKV）、HIV等病毒的RNA也可通過ddCRISPR進行檢測。一鍋法數字RPA–Cas13a檢測等方案簡化了流程。
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微小RNA（miRNA）：miRNA是重要的疾病標志物，尤其與癌癥相關。無擴增的ddCRISPR（如PddCas13a assay, ultralocalized Cas13a assay）能夠直接、高靈敏度地檢測miR-21、miR-17、circHIPK3等分子，在癌癥液體活檢和診斷中具有應用前景。
挑戰與未來展望
盡管ddCRISPR技術優勢明顯，但其走向廣泛應用仍面臨一些挑戰：
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自動化與便攜性：當前許多ddCRISPR工作流程涉及多個手動步驟，限制了其在床旁或資源有限環境下的應用。開發全自動、集成化的微型設備是未來的重要方向。無儀器或低儀器依賴的液滴生成方法（如重力驅動、離心微流控、渦旋乳化）有助于簡化操作。
- 2.
液滴穩定性與均一性：液滴的蒸發、融合以及尺寸不均會影響定量準確性。優化表面活性劑、芯片材料和液滴生成條件至關重要。
- 3.
多重檢測能力：同時檢測多個靶標是提高診斷效率的關鍵。通過光譜編碼、振幅編碼或條形碼策略實現多重ddCRISPR檢測是研究熱點，但也面臨信號串擾等挑戰。
- 4.
檢測靈敏度與特異性平衡：特別是在無擴增策略中，如何進一步提高對極低豐度靶標的檢測靈敏度，同時保持高特異性，需要優化Cas酶、報告系統及反應條件。
- 5.
成本與可及性：降低試劑和設備成本，使技術更易于推廣。
未來，ddCRISPR技術的發展將受益于多個方向的進步：
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人工智能（AI）驅動診斷：AI算法可用于優化液滴生成參數、提高液滴圖像分析和分類的準確性及效率，實現實時反饋控制，提升檢測的穩健性和自動化水平。
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床旁檢測（POCT）集成：結合智能手機讀值、低成本芯片材料和便攜式設備開發，將使ddCRISPR更適用于現場快速診斷。
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新型CRISPR系統與材料：探索具有更高活性、更廣PAM序列兼容性或新功能的Cas變體，以及開發更穩定的液滴體系和反應載體，將拓寬應用范圍并提升性能。
結論
液滴數字CRISPR（ddCRISPR）技術通過將CRISPR的精準識別與液滴微流控的數字化定量能力深度融合，為核酸檢測領域帶來了革命性的進步。其在靈敏度、特異性、定量準確性以及應對復雜樣本方面的卓越表現，使其在疾病診斷、病原體監測、食品安全和環境檢測等領域展現出巨大的應用潛力。盡管在自動化、多重檢測和便攜性方面仍需進一步突破，但隨著技術的不斷成熟和創新，ddCRISPR有望發展成為下一代分子診斷的核心工具，為精準醫療和公共衛生安全提供強大支撐。
