《Microchemical Journal》：A one-step, extraction-free RPA-CRISPR/EsCas13d platform for rapid, sensitive and visual detection of PCV2
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SHIELD平臺通過整合RPA擴增、T7轉錄和Cas13d檢測實現單管一步法病毒診斷，無需核酸提取且可在30分鐘內完成，適用于資源有限環境。
Jia-qi Duan|Yang-ming Dai|Tong Xu|Yuan-meng Wang|Lei Zhao|Dong You|Fang Wu|Si-Yuan Lai|Yi Qing|Liang-Peng Ge|Zuo-Hua Liu|Jing Sun|Xiu Zeng|Ling Zhu|Zhi-wen Xu
四川農業大學獸醫學院，中國成都611130
摘要
人類和動物的傳染病爆發持續給全球健康和經濟帶來巨大負擔，這凸顯了開發創新診斷技術以控制傳播的迫切需求。在這項研究中，我們介紹了SHIELD（Streamlined Hazard Identification for Epidemic Limitation and Defense）平臺，這是一種無需提取樣本的RPA-CRISPR/EsCas13d技術，能夠在資源有限的環境中實現快速、準確的檢測。我們優化了檢測流程，使RPA、T7轉錄和CRISPR/EsCas13d切割能夠在同一管中進行，從而簡化了工作流程并將總檢測時間縮短至30分鐘。快速核酸釋放技術消除了對實驗室提取和復雜加熱程序的需求，進一步提高了SHIELD的操作簡便性。SHIELD可以在體溫（37°C）和室溫（25°C）下運行，這是邁向無需恒溫器設備的重要一步。使用改良的凍干試劑減少了冷鏈要求，簡化了檢測準備過程，使其便于低成本運輸和現場應用。SHIELD能夠靈敏地檢測豬圓環病毒2型（PCV2），并提供兩種可視化讀數模式——470納米紫外光和側向流動分析（LFA），便于在不同環境中靈活解讀檢測結果。我們使用62個臨床樣本驗證了SHIELD的準確性，其靈敏度和特異性均達到定量聚合酶鏈反應（qPCR）的水平，證明了其作為即時檢測和現場應用的強大診斷工具的潛力。
引言
近年來，人類和動物中的傳染病爆發——如SARS-CoV-2、寨卡病毒（ZIKV）、猴痘（MPXV）和豬圓環病毒2型（PCV2）——給全球健康和經濟帶來了重大影響[1]、[2]、[3]。傳統的病原體核酸檢測通常需要將樣本運輸到中心實驗室進行處理和分析。qPCR被公認為當前病毒檢測的金標準，具有高靈敏度和特異性[4]、[5]。然而，它受到集中采樣、較長檢測時間和依賴實驗室基礎設施的限制。即時檢測（POCT）在應對這些挑戰方面發揮著關鍵作用。通過使用等溫擴增技術（如環介導等溫擴增（LAMP）[6]和重組酶聚合酶擴增（RPA）[7]、[8]、[9]、[10]，可以規避對熱循環儀的依賴。然而，RPA存在氣溶膠污染的風險，而LAMP檢測的靈敏度有限[11]。因此，需要在等溫擴增方法上進行進一步創新，以實現低成本、高通量的現場檢測。最近，基于CRISPR/Cas的診斷平臺（CRISPR-Dx）作為一種極具前景的POCT工具出現，具有快速檢測、高特異性和簡單反應條件等優點[12]、[13]、[14]。盡管CRISPR診斷與等溫擴增的結合可以克服各自的局限性，但往往會增加操作復雜性[15]、[16]。SHERLOCK和DETECTR[17]、[18]這兩種兩步CRISPR診斷方法分別依次進行等溫擴增和CRISPR檢測，導致檢測時間延長、工作流程復雜化以及氣溶膠污染風險增加[19]、[20]。為了解決這些問題，開發了單步平臺如SCOPE[21]和HOLMESv2[22]。然而，盡管這些方法具有潛力，但它們通常側重于設備創新，且獲取核酸的過程仍需要加熱模塊或其他復雜儀器，這限制了其在POCT中的應用。
目前大多數基于CRISPR的診斷方法使用Cas12和Cas13蛋白[6]；然而，在基于Cas12a的單管反應中，目標DNA與RPA的競爭性結合會導致DNA模板意外降解，從而影響檢測效率[23]。此外，其對特定原間隔序列（PAM）的依賴性限制了crRNA設計的靈活性和靶向范圍[24]、[25]。與其他CRISPR系統不同，Cas13針對單鏈RNA，消除對PAM或原間隔序列（PFS）的依賴性，從而提高了crRNA設計的靈活性[17]。在Cas13變體中，Cas13d體積更小，比其他Cas13蛋白更容易純化，但其應用尚未得到充分探索[26]、[27]。在我們之前的研究中[28]、[29]，EsCas13d在病毒檢測中表現出優異性能；但我們的研究遇到了一些關鍵限制：（1）依賴實驗室核酸提取；（2）非凍干試劑影響運輸和儲存；（3）缺乏無儀器條件下的驗證；（4）對一步法所需緩沖液成分的研究不足。
PCV2是一種全球流行的病原體，會導致豬圓環病毒相關疾病（PCVAD），引發免疫抑制并使豬易受共感染，每年造成數十億美元的經濟損失[30]。我們利用PCV2作為模型來驗證SHIELD平臺在病毒檢測中的有效性。SHIELD將RPA、T7轉錄和Cas13d檢測整合到一步檢測中，從而最小化了工作流程的復雜性并縮短了反應時間。本研究中使用的快速核酸釋放試劑克服了傳統提取方法的復雜性和對儀器的依賴性，提供了比基于加熱的HUDSON方法[31]更簡便的替代方案，并滿足了POCT對無儀器環境的要求。此外，SHIELD在室溫下進行反應，并使用快速核酸釋放試劑，實現了現場檢測，提高了時間和空間的靈活性。此外，改良的凍干試劑的研制便于運輸和儲存。這些進展使SHIELD成為資源有限環境中快速、靈敏且易于應用的診斷工具。
實驗步驟片段
病毒裂解
PCV2、PRV、PRRSV、JEV、PEDV、CSFV和GETV的樣本由四川省四川農業大學提供。使用商用核酸提取試劑提取病毒DNA或RNA，隨后通過逆轉錄合成cDNA，并與DNA一起儲存在-80°C下。為了評估兩步法和一步法SHIELD方法的臨床適用性，樣本按照世界衛生組織推薦的生物安全協議無菌采集。
SHIELD原理
我們開發了一種快速、可現場部署且無需儀器的CRISPR/EsCas13d診斷系統，稱為SHIELD。如圖1所示，拭子樣本使用無需提取的試劑處理，隨后進行一步SHIELD反應，該反應將RPA、T7轉錄和CRISPR/Cas13d檢測整合到一個步驟中。雙鏈DNA擴增子在正向引物的5′端帶有T7啟動子，從而促進其轉錄為單鏈RNA。討論
近年來，人類和動物的傳染病爆發給全球健康帶來了巨大壓力[36]、[37]。持續的現場流行病學監測至關重要，因為早期檢測和及時干預對于遏制傳播和減輕生產影響至關重要[38]。在這種情況下，快速、靈敏和準確的基于核酸的POCT技術的發展變得越來越重要。其中，CRISPR-Dx技術結論
總之，本研究成功建立了一種基于RPA-CRISPR/EsCas13d的快速、靈敏且可視化的單步檢測方法，顯示出對PCV2的優異靈敏度和特異性。快速核酸釋放試劑的應用以及在室溫和體溫下進行反應的能力使SHIELD幾乎不需要專用儀器。此外，凍干工藝簡化了操作流程。
CRediT作者貢獻聲明
Jia-qi Duan：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，可視化，驗證，軟件，資源，方法學，調查，數據分析，數據管理。Yang-ming Dai：軟件，資源，方法學。Tong Xu：可視化，驗證，方法學。Yuan-meng Wang：可視化，軟件，方法學。Lei Zhao：方法學，數據分析。Dong You：可視化，軟件，方法學。Fang Wu：方法學，數據分析。Si-Yuan Lai：監督，概念構思。倫理批準和參與同意
涉及動物實驗的研究獲得了四川農業大學實驗動物管理委員會的批準（批準編號20240528）。這些研究遵循了當地法規和機構協議。已從動物所有者處獲得書面同意，允許它們參與本研究。本手稿不包含任何與人類相關的研究內容，也不包含可能識別個人身份的數據或圖像。資金聲明
作者聲明本研究及/或文章的發表獲得了財政支持。該工作得到了國家重點研發計劃（項目編號2024YFD1800500，“重大豬病綜合預防、控制和凈化技術的研究與應用”；項目編號2024YFD1800102，“重要野生動物疾病預防和控制關鍵技術的研究”）和四川省重大項目的支持利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文所述的工作。
