犬瘟熱病毒（CDV）屬于麻疹病毒屬（副黏病毒科），是一種高度傳染性且常致命的多系統疾病（Bi等人，2015年；Rima等人，2019年）。它具有非分段的負鏈單鏈RNA基因組，編碼六種結構蛋白，即核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大蛋白（L）以及兩種非結構蛋白（C和V）（Rendon-Marin等人，2019年）。編碼N蛋白的基因常被選為CDV核酸檢測的目標區域（Fu等人，2016年；Wang等人，2017年；Xu等人，2012年），其變異程度較低（Ricci等人，2021年；Rima等人，1995年；Wipf等人，2025年）。CDV可通過直接接觸或間接接觸（如氣溶膠傳播和接觸呼吸道及眼部分泌物）廣泛感染犬科和鼬科的食肉動物，包括狗、水貂、狐貍和貉（Deem等人，2000年；Zhou等人，2024a）。據報道，它還能通過狗傳播給許多野生食肉動物，如西伯利亞虎、埃塞俄比亞狼和其他瀕危物種（Zhang等人，2017年），以及獵豹和獅子（Mourya等人，2019年；Zhang等人，2017年），被認為是多種家養和野生動物新的病毒風險（Seimon等人，2013年）。

由CDV引起的犬瘟熱（CD）是一種在全球范圍內發病率高且死亡率高的地方性疾病，在寒冷季節發病率更高（Karki等人，2022年；Martella等人，2008年）。在早期階段，感染動物可能表現出非特異性臨床癥狀，如厭食、抑郁、結膜炎和趾部角化過度。然而，疾病會發展為嚴重的呼吸系統、胃腸道和神經系統癥狀，導致多系統癥狀（Iribarnegaray等人，2024年）。在此過程中，動物的免疫系統也會受到影響，導致嚴重的免疫抑制，出現雙相發熱、咳嗽、腹瀉和厭食等癥狀（Karki等人，2022年）。犬類的神經系統癥狀通常是致命的，幸存者會表現出持續的神經功能障礙，需要終生管理（Iribarnegaray等人，2024年）。因此，快速準確的CDV診斷方法對于及時識別亞臨床攜帶者和在感染早期提供病因治療至關重要，從而防止臨床癥狀惡化并遏制病毒向易感宿主的傳播。

雖然常規臨床發現可以為CDV感染提供初步診斷支持，但由于無癥狀攜帶者的普遍存在以及感染動物在病毒早期階段缺乏特異性臨床表現，這些發現不足以進行確診（Rivera-Martínez等人，2024年）。因此，實施經過驗證和標準化的CDV診斷方法對于生成重要的流行病學數據以指導治療策略、優化疫情控制方案和降低高密度犬群中的傳播風險至關重要。傳統的檢測方法由于CDV的致病特性或檢測方法的局限性，不適合快速、方便和準確的CD診斷。病毒分離雖然具有確診能力，但耗時較長（數天至數周），不適合臨床使用（Elia等人，2006年；Rivera-Martínez等人，2024年）。目前，如ELISA等血清學檢測方法具有相對較高的靈敏度和特異性，但之前的疫苗接種和/或感染狀態可能會影響檢測結果（Egerer等人，2022年；Elia等人，2006年；Sarchahi等人，2022年）。相比之下，核酸檢測方法可能是一種更可靠的檢測方法，能夠應對不同情況（Wang等人，2018年）。盡管逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）具有高靈敏度，但它們需要專用設備和受過培訓的人員，限制了其在即時檢測（POCT）中的應用（Becker等人，2024年；Hu等人，2022年；Zhou等人，2023年）。因此，迫切需要快速、無需設備且可在現場使用的診斷工具。

規律間隔的短回文重復序列簇和相關核酸酶（CRISPR-Cas）系統為快速和敏感的分子診斷提供了潛在應用（Chen等人，2018年；Gootenberg等人，2018年）。CRISPR-Cas系統是一種RNA引導的適應性免疫系統，可保護細菌和古菌免受外來核酸的入侵（Abudayyeh等人，2016年；Barrangou等人，2007年；Marraffini和Sontheimer，2008年）。CRISPR-Cas13a系統通過識別和檢測目標RNA序列來激活Cas核酸酶的切割/降解活性，無差別地切割附近的單鏈RNA（ssRNA）。實驗研究表明，CRISPR-Cas13a具有單堿基對識別能力（Gootenberg等人，2017年），這是保持核酸識別高準確性的關鍵特性。在檢測系統中添加兩端標記有熒光素或抗原的單鏈RNA作為報告分子，最終檢測結果可通過qPCR儀器或側向流動條帶顯示，肉眼可見。結合等溫擴增步驟（如重組酶聚合酶擴增（RPA）/重組酶輔助擴增（RAA）技術，在37–42°C溫度范圍內擴增核酸，基于CRISPR-Cas13a的檢測方法通常可以實現敏感和快速的檢測過程（Zhang等人，2022年）。近年來，基于CRISPR-Cas系統的核酸檢測技術在快速準確診斷主要人類和動物傳染病方面取得了顯著成功，如2019冠狀病毒病（COVID-19）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、禽流感病毒（AIV）、猴痘病毒和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）（Hu等人，2022年；Wang等人，2024a；Wang等人，2024b；Wu等人，2023年）。在本研究中，我們旨在建立一種結合RAA、側向流動條帶和CRISPR-Cas技術的新型平臺，用于CDV RNA檢測，該方法既準確又靈敏，操作快速簡便，不再受操作者和設備的限制，有助于CD的治療和預防。

我們開發了一種便攜式的RAA-CRISPR-Cas13a檢測方法，用于CDV RNA檢測，整合了HUDSON技術（加熱未提取的診斷樣本以滅活核酸酶），可在1.5小時內使用qPCR儀器或側向流動條帶獲得結果，提供了前所未有的速度、靈敏度和操作靈活性。這種方法在資源有限的環境或極端天氣條件下尤其有價值，因為傳統診斷方法在這種情況下不方便使用。