現場可應用的柑橘類植物由鏈格孢菌（Alternaria）引起的病害診斷方法：利用CRISPR/Cas12a技術擴增的PGM（Phytochrome-Gated Membrane）信號蛋白進行檢測
《Microchemical Journal》：Field-deployable Citrus
Alternaria diagnosis using CRISPR/Cas12a-amplified PGM signaling
編輯推薦：
柑橘黑斑病菌檢測方法開發：基于CRISPR/Cas12a、TSA信號放大與便攜式血糖儀的快速診斷系統，靈敏度達50 pM，特異性驗證及實際樣本檢測均顯示良好性能。
馬蘭瑞|楊璐|董繼堯|謝龍英子|吳琦|崔永亮|張耀海|鄭浩|王成秋|何月
農業農村部柑橘果實質量安全控制重點實驗室，西南大學，國家柑橘工程技術研究中心，柑橘研究所，重慶400712，中國
摘要
由鏈格孢引起的柑橘褐斑病的傳播是對柑橘產業最具破壞性的威脅之一。本文提出了一種基于CRISPR/Cas12a的鏈格孢檢測平臺。結合磁分離技術，通過HRP介導的酪胺信號放大技術和鏈霉親和素與生物素的有效結合技術，成功將大量生物素化轉化酶錨定在金納米顆粒上。最后，使用個人血糖儀讀取檢測信號。該方法可以檢測到濃度低至50 pM的合成目標雙鏈DNA，并顯示出令人滿意的特異性。通過對鏈格孢細胞和田間樣本的分析，證實了該方法的實用性。值得注意的是，使用我們的方法獲得的結果與qPCR的結果一致。這種創新方法方便、成本低廉，且提供與qPCR檢測結果一致的結果，從而有助于現場診斷鏈格孢。
引言
柑橘是最重要的水果作物之一，在137多個國家進行商業化種植。[1]然而，柑橘在生長發育過程中總是受到生物脅迫的影響，尤其是病原體的影響。[2]鏈格孢是一種常見的植物病原體，會導致柑橘褐斑病，造成巨大的經濟損失，并嚴重阻礙柑橘產業的發展。[3],[4]此外，鏈格孢的代謝產生的霉菌毒素可能存在于柑橘果實中，食用這些食物可能導致嚴重的健康問題，包括畸形、癌癥、突變等。[5]隨著柑橘生產和消費的不斷擴大，鏈格孢對人類健康的威脅日益增加，可能帶來嚴重的后果。因此，有必要在鏈格孢感染的早期階段準確檢測其存在。這有助于實現有效的植物病害管理，減輕經濟損失并確保食品安全。
目前用于識別鏈格孢的方法主要包括傳統的形態分析和核酸分析。[6]盡管基于培養的檢測方法可以提供可靠的結果，但由于在感染早期可用的細菌菌株非常少，這些方法耗時且勞動強度高。[7]最近，以非等溫擴增技術[8]和等溫擴增技術[2],[9]為代表的核酸擴增技術在鏈格孢的檢測中表現出優異的診斷性能。然而，基于核酸擴增的技術需要昂貴的設備、專業操作和熟練工人，不適合資源有限的地區。[10]因此，在工業發展和食品安全監督中，需要價格合理、便攜且具有特異性的新方法來進行鏈格孢的即時檢測（POCT）。
成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關（Cas）蛋白系統是細菌的獲得性免疫系統。[11],[12],[13]由于CRISPR/Cas系統能夠精確識別目標核酸序列，基于該系統的新型生物傳感器在近年來顯示出優異的核酸檢測性能。[14],[15]Cas12a是Cas蛋白家族的成員，作為一種RNA引導的內切酶，具有對非特異性單鏈DNA（ssDNA）的轉切活性。[16],[17],[18]基于這一特性，Cas12a促進了核酸檢測多個領域的即時檢測技術的發展，包括病毒[19]、轉基因作物[20]和病原菌[21]。結合核酸預擴增技術[1],[22]，這種激活模式使Cas12a/crRNA介導的ssDNA切割能夠實現熒光檢測。然而，熒光檢測方法需要昂貴的儀器和受過培訓的操作人員。[23]在某些情況下，基于Cas12a的即時檢測技術的成功商業化需要考慮便攜式設備用于信號記錄。[24],[25]
個人血糖儀（PGM）具有低成本、體積小、易于使用和高可靠性等優點。[26],[27],[28]近年來，研究人員開發了多種傳感器來克服PGM在非葡萄糖檢測方面的局限性。[29]轉化酶介導的蔗糖到葡萄糖的轉化使PGM能夠檢測多種分析物，包括核酸[30]、蛋白質[31]、毒素[32]、酶[31]等。周等人[33]提出了一種基于CRISPR/Cas12a和PGM的沙門氏菌檢測方法，檢測限為5個菌落形成單位。方等人[34]提出了一種改進的CRISPR-PGM方法，用于檢測SARS-CoV-2 N基因或hDNA，分別達到了50個拷貝/μL和11.0 fM的檢測限。因此，PGM和CRISPR/Cas12a系統的結合有望構建一個用戶友好且特定的現場可部署的診斷系統。此外，為了提高檢測靈敏度，我們打算引入經典的酪胺信號放大（TSA）[35],[36]策略。TSA策略利用辣根過氧化物酶（HRP）催化的酪胺偶聯物在目標蛋白附近沉積，從而放大檢測信號。[35]作為一種有效的方法，TSA策略在細菌[37]、病毒[38]、細胞[39]等領域的診斷中受到了越來越多的關注。
最近，金納米顆粒（AuNPs）由于其生物相容性和較大的表面積，成為共載酶和ssDNA的理想納米載體。[40]胡等人[41]報道了一種基于冷凍的方法，可以使ssDNA和HRP同時附著在AuNPs表面。通過將HRP錨定在AuNPs表面，我們旨在整合AuNPs的信號放大特性和TSA。這種方法有望促進AuNPs上的多次TSA反應，從而提高檢測靈敏度。
鑒于上述情況，建立了一種基于CRISPR/Cas12a系統、TSA策略和PGM讀數的鏈格孢檢測方法。核酸的濃度調節CRISPR/Cas12a系統的轉切活性，從而使得檢測溶液中PGM信號的變化與鏈格孢基因的濃度之間存在強相關性。該方法的特異性和靈敏度源于CRISPR/Cas12a的識別能力和TSA的信號放大的有效結合。此外，通過對培養的鏈格孢、其他與柑橘病相關的微生物以及柑橘植物田間樣本的分析，驗證了該方法的實用性。該方法的良好性能表明它在快速現場檢測鏈格孢污染方面具有巨大潛力。此外，它為在資源有限的地區擴展基于Cas12a的POCT的應用以及使用PGM分析非葡萄糖目標提供了有前景的方法。
合成雙鏈DNA激活劑分析
首先，混合7.5 μL無DNase/RNase的水、2 μL Holmes緩沖液（10 ×）、2 μL合成雙鏈DNA（10 nM）（無模板對照使用無DNase/RNase的水）、4.5 μL底物單鏈DNA（50 nM）、2 μL LbCas12a（500 nM）和2 μL crRNA（1 μM），然后在45°C下孵育40分鐘。接下來，將15 μL捕獲探針和15 μL耦合緩沖液混合，在25°C下孵育10分鐘。之后，用耦合緩沖液清洗三次。
提出的CRISPR/Cas12a-TSA-PGM方法原理
提出的CRISPR/Cas12a-TSA-PGM方法的原理如圖1所示。具體來說，長度為27個堿基的單鏈DNA作為CRISPR/Cas12a 轉切反應的底物（表S1）。首先，部分與底物單鏈DNA互補的捕獲單鏈DNA被固定在SA-MBs表面，形成捕獲探針（圖S1）。與底物單鏈DNA剩余部分互補的信號單鏈DNA與HRP一起被
結論
總之，我們成功開發了一種用于診斷鏈格孢感染的檢測方法，該方法結合了CRISPR技術和TSA，并使用市售的PGM作為信號讀出設備。PGM作為最廣泛采用的便攜式即時檢測儀器之一，具有便攜性、低成本、快速響應、用戶友好操作和直觀結果等固有優勢，這些都有助于該方法的實用性。
CRediT作者貢獻聲明
馬蘭瑞：撰寫 – 審稿與編輯、撰寫 – 原稿、軟件、方法學、調查、數據分析、概念化。
楊璐：撰寫 – 審稿與編輯、撰寫 – 原稿、軟件、數據分析。
董繼堯：撰寫 – 審稿與編輯、軟件。
謝龍英子：可視化、軟件。
吳琦：軟件、方法學。
崔永亮：資源支持。
張耀海：驗證、方法學。
鄭浩：資源支持、資金獲取。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文報道工作的財務利益或個人關系。
致謝
我們感謝中國農業研究系統（編號：CARS-26）的財政支持。
