《Bioresource Technology》：Strategic enrichment of ammonia-oxidizing archaea biofilms coupled with process optimization for mitigating N
2O emissions in wastewater treatment system
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stilbenoid生物合成研究通過工程大腸桿菌實現了高效生產，采用CRISPRi動態調控malonyl-CoA分配平衡代謝，結合結構導向計算分析與正交標記系統優化酶共定位和中間體傳遞，使piceatannol產量達583.10 mg/L，pterostilbene達1110.92 mg/L，并驗證了技術經濟可行性。
趙國富|李鵬派|丁新耀|呂久功|楊穎|劉琳|子莉涵|張強|梁麗婭|劉榮明
中國大連理工大學生物工程學院生物智能制造重點實驗室，大連 116024
摘要
芪類化合物是具有強生物活性的植物來源多酚，這使它們在制藥和營養保健品領域具有巨大潛力。然而，由于其在植物中的天然含量較低以及化學合成過程中存在的毒性問題，其生產仍然具有挑戰性。在這里，我們開發了一種綜合策略，對大腸桿菌（Escherichia coli）進行改造，以實現多種芪類化合物的高效生物合成。我們利用對香豆酸（p-coumaric acid）具有響應性的CRISPRi系統動態調節丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）的分配，從而平衡宿主代謝和芪類化合物的生產。我們系統地探討了酶共定位策略，并利用基于結構的計算機模擬（in silico）分析來支持雙酶融合設計。正交的SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher系統實現了最佳的中間產物通道化，顯著提高了代謝途徑的通量。結果，我們從甘油中合成了最高濃度的白藜蘆醇（494.30 mg/L，添加L-酪氨酸后提高到583.10 mg/L）和飛燕草素（563.89 mg/L，添加L-酪氨酸后提高到1110.92 mg/L）。技術經濟分析表明，通過優化代謝調控、酶共定位和工藝設計，顯著提升了芪類化合物生產的可行性。總體而言，本研究展示了芪類化合物生物合成的潛力，并為其他復雜天然產物的高效合成提供了有價值的范例。
引言
芪類化合物是一類植物來源的多酚類次級代謝產物，具有廣泛的藥理活性，包括抗癌、抗氧化和抗炎作用（Costa等人，2022；Culp等人，2024；Kuziel等人，2025）。這些生物活性特性在營養保健品和制藥行業中引起了廣泛關注（Reimer等人，2022；Wang等人，2025；Zhou等人，2025）。然而，芪類化合物的化學合成存在純化困難、使用有毒試劑、需要苛刻的條件以及較大的環境足跡等問題，這些因素嚴重限制了其大規模生產（Kumar等人，2021）。此外，芪類化合物在植物中的天然含量極低（例如，白藜蘆醇：0.03–15 mg/kg；飛燕草素：0.0441 mg/kg；白藜蘆醇：20.8 mg/kg）（Ispiryan等人，2024；Lourencao Zomer等人，2021；Zhang等人，2022），導致生產效率低下且不可持續。通過代謝工程進行微生物合成已成為一種有前景的可持續替代方法。然而，微生物合成的芪類化合物產量仍然較低，且可擴展性有限。
雖然經過改造的大腸桿菌已經能夠利用簡單的碳源（Heo等人，2017；Hong等人，2020；Li等人，2022；Park等人，2021；Yan等人，2023）或添加的中間產物（如L-酪氨酸、香豆酸、白藜蘆醇和丙二酸）來合成芪類化合物（Jeong等人，2014；Shrestha等人，2018；Wu等人，2017；Zhao等人，2018），但前體物質（芳香族氨基酸和丙二酰輔酶A）的供應不足仍然是芪類化合物生產的主要瓶頸。目標產物的合成通常需要從共同的代謝節點轉移多個前體；當過多的碳流被用于合成所需化合物時，會引發碳流沖突，干擾正常的細胞過程并降低產物的產量（Park等人，2021；Wang等人，2024a；Yan等人，2023）。因此，要實現高產量的芪類化合物生產，必須建立一種動態機制，以平衡芪類化合物合成和細胞生長所需的碳流。
此外，芪類化合物代謝途徑的多酶級聯結構帶來了嚴重的代謝負擔。這些漫長的合成途徑消耗了細胞內的碳流，而酶在細胞內的空間分散加劇了代謝產物的擴散損失；非特異性的酶-酶相互作用產生了不必要的副產物，基因表達失衡導致有毒中間產物的積累。這些因素共同嚴重降低了最終產品的產量。傳統的柔性連接劑（Wang等人，2011）、模塊化組裝（如SpyTag/SpyCatcher介導的融合Jia等人，2022）以及利用計算機模擬的多酶組裝方法（iMARS）設計的人工融合酶（Wang等人，2025）雖然成功提高了香豆酸和白藜蘆醇的產量，但它們的效果高度依賴于具體設計。只有某些配置被證明能提高活性（Liu等人，2022），而許多其他配置則破壞了蛋白質的折疊結構或降低了催化效率（Chen等人，2022；Liu等人，2021；Qin等人，2021）。例如，Ding等人在酵母中證明，基于GGGGS的ZL2W連接劑在crtZ和crtW之間顯著提高了蝦青素的產量，同時減少了玉米黃質和角黃質的副產物生成；而其他配置則導致產量下降和副產物增加（Ding等人，2023）。這些觀察結果突顯了酶融合設計的敏感性，并強調了需要系統性的途徑工程方法來提高酶的兼容性、維持代謝通量的平衡，并支持整個芪類化合物合成途徑的高效催化。
為了解決微生物芪類化合物合成中的關鍵代謝限制，不僅需要克服多酶級聯中的局部效率問題，還需要解決關鍵前體物質的全球競爭問題。雖然酶共定位通過減少中間產物的擴散提高了途徑效率，但它本身無法解決前體在生產和細胞生長之間的動態分配問題。在這里，我們建立了一個模塊化且綜合的代謝工程框架，該框架將前體流量調節與途徑結構協調起來，實現代謝資源的有效重新分配，同時最小化中間產物的損失。具體而言，該框架包括增強前體生成代謝、適應性地平衡丙二酰輔酶A的流量以滿足生長和生產的需要，以及空間組織途徑酶以改善底物通道化和催化效率。這一框架的通用性已在多種芪類化合物產品中得到驗證，并通過技術經濟分析評估了其工業應用價值。
菌株和質粒
質粒和菌株的詳細信息見補充材料。質粒構建是在大腸桿菌DH5α中完成的。引物信息也列在補充材料中。本研究中使用的酶的來源和登錄號同樣在補充材料中提供。起始菌株為L-苯丙氨酸過表達菌株ES23。ES23（DE3）用于構建質粒的功能表達以及白藜蘆醇、白藜蘆醇和飛燕草素的生產。
從酪氨酸合成白藜蘆醇的代謝途徑
為了構建異源白藜蘆醇代謝途徑，我們將來自Phanerochaete chrysosporium的酪氨酸氨裂解酶（TAL）、來自Arabidopsis thaliana的4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）以及來自Vitis vinifera的突變型芪類合成酶（VvSTS-T50I/V170A）引入ES23菌株，得到了ES23-r1菌株（圖1a和b）。經過IPTG優化后（見補充材料），ES23-r1在48小時內積累了68.84 mg/L的白藜蘆醇和164.24 mg/L的香豆酸（圖1c和d）。
由于每分子香豆酸需要三個丙二酰輔酶A分子
結論
在這項研究中，我們開發了一種綜合的代謝工程策略，結合了動態的丙二酰輔酶A調節和正交的酶共定位技術，實現了大腸桿菌中多種芪類化合物的高效生物合成。該方法顯著提高了白藜蘆醇、白藜蘆醇和飛燕草素的產量，其中表現最佳的菌株在補料批次條件下達到了創紀錄的產量（白藜蘆醇583.10 mg/L，飛燕草素1110.92 mg/L）。
CRediT作者貢獻聲明
趙國富：撰寫原始稿件、方法學設計、實驗研究、數據分析、數據管理。李鵬派：撰寫原始稿件、驗證結果、軟件開發。丁新耀：數據管理。呂久功：數據可視化。楊穎：項目監督。劉琳：數據可視化。子莉涵：數據管理。張強：方法學設計。梁麗婭：撰寫、審稿與編輯、結果驗證、資源協調、項目管理。劉榮明：撰寫、審稿與編輯、結果驗證、資源協調、項目管理。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本工作得到了遼寧省自然科學基金（2025JH2/101330156、2024-MSBA-09、2025-BS-0025）、國家自然科學基金（22278058、22208044、22578048、62503077）、國家重點研發計劃（2023YFC3402300）、青年教師科研創新能力支持項目（SRICSPYF-ZY2025107）、“興遼人才計劃”（XLYC2203075）以及大連市科技創新基金的支持。
