《Biosensors and Bioelectronics》：A turn-on CRISPR/Cas12a strategy featuring a sterically- hindered activator for in situ fluorescence imaging of H
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實時熒光成像檢測活體過氧化氫的新策略基于化學門控CRISPR/Cas12a系統，實現高靈敏度（0.64 μM）和快速響應（<90分鐘）的H?O?檢測，適用于腫瘤微環境和活細胞動態監測。
李志強|張文賢|馮哲|劉正|馮志遠|史陽|詹家銀|張靜靜
長春理工大學化學與環境工程學院，中國長春130022
摘要
過氧化氫（H2O2）是癌癥和炎癥等病理過程中氧化應激的關鍵生物標志物。然而，由于其缺乏敏感、快速且生物正交的成像方法，其在體內的可視化仍然具有挑戰性。在這里，我們提出了一種可被H2O2激活的CRISPR/Cas12a策略，稱為A-BO-CRISPR，用于活體系統的實時熒光成像。該生物傳感策略使用了一種4-溴甲基苯基硼酸蒎醇酯封裝的DNA激活劑，其與crRNA的結合最初受到空間位阻的阻礙，從而有效抑制了Cas12a的切割活性。當遇到內源性H2O2時，硼酸酯被選擇性水解，恢復激活劑/crRNA的雜交，并通過Cas12a介導的ssDNA報告基因的切割產生放大的熒光信號。該系統的檢測限為0.64 μM，并能在幾分鐘內作出響應，實現對活細胞和攜帶腫瘤的小鼠中H2O2流動的實時監測。它在復雜的生物環境中表現出高選擇性和穩健的穩定性。通過將化學門控機制與基于CRISPR的信號放大相結合，這項工作為探究氧化還原生物學、成像引導的診斷和治療監測開辟了新的途徑。
引言
過氧化氫（H2O2）是一種高反應性的氧物種（ROS），被認為是氧化損傷的強誘導劑以及衰老和炎癥的介質。[1], [2], [3] 在正常細胞中，H2O2的濃度維持在1-700 nM，但在腫瘤中會升高到超過100 μM，使其成為致癌轉化的關鍵生物標志物。[4], [5] 目前的檢測方法——比色法、質譜法和電化學法——僅限于裂解物或滲出物的檢測。[6], [7], [8] 盡管光學和磁共振成像已應用于活體樣本，但這些方法存在對比度低、背景信號高和材料成本高的問題。[9], [10] 一種基于化學修飾的H2O2成像生物傳感策略，結合了優異的識別能力和出色的信號放大能力以及深組織兼容性，目前仍然難以實現。
最近，來自原核生物的規律間隔短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關（Cas）蛋白系統已被重新用作可編程的分子開關。[11], [12], [13], [14] 其中，Cas12a（Cpf1）因其表現出依賴目標的雜散DNase活性而脫穎而出，這是切割旁觀者單鏈DNA（ssDNA）報告基因的前提條件。這使得無需擴增即可以飛摩爾靈敏度、高選擇性和快速響應來靶向非核酸分析物。[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] 盡管CRISPR/Cas系統具有巨大潛力，但在體內應用中按需激活CRISPR/Cas12系統仍面臨各種干擾。研究人員采用了基于空間位阻的策略來阻斷酶活性，這依賴于Cas蛋白或crRNA的空間位阻掩蔽。蛋白質級別的封裝需要多步驟的復雜 conjugation，即使CRISPR/Cas系統被激活，也可能犧牲Cas蛋白的折疊和催化效率。[23], [24], [25] 而crRNA級別的阻斷主要發生在連接到核糖糖、磷酸或核堿基的2’-OH上，導致Cas12a/crRNA核糖核蛋白（RNP）組裝延遲，激活滯后時間長達數十分鐘。[26], [27], [28], [29], [30] 然而，捕捉如H2O2爆發這樣的瞬態氧化還原事件需要在活體系統中使用更小的時間窗口和快速的動力學（圖1A）。
為了解決上述問題，我們設計了一種基于預組裝RNP的H2O2門控CRISPR/Cas12a電路（A-BO-CRISPR）（圖1B），無需操縱crRNA或Cas蛋白。通過將4-溴甲基苯基硼酸蒎醇酯（BOBr）連接到激活劑DNA的磷酸硫酯骨架上，可以空間位阻地阻止DNA鏈與crRNA之間的雜交，從而將Cas12a鎖定在“關閉”狀態。當遇到升高的H2O2水平時，硼酸酯可以被氧化成酚類物質，隨后發生自發的快速1,6-消除反應，解除對磷酸硫酯的掩蔽并恢復激活劑的全部功能。[31] 這種化學“解耦劑”將H2O2濃度直接轉化為Cas12a的切割活性，導致熒光團-淬滅劑標記的ssDNA報告基因迅速非特異性降解，使熒光團在幾分鐘內發出熒光。整個RNP激活過程在原位進行，具有高時間分辨率和最小的背景噪聲，能夠實時成像活體小鼠腫瘤微環境（TME）中的內源性H2O2水平波動（圖1C）。
A-BO-CRISPR系統的制備
首先，在37 °C下將2 μL的Cas12a（10 μM）與1 μL的crRNA（10 μM）和2 μL的Tris緩沖液混合15分鐘以形成RNP。接下來，將2 μL的預組裝RNP（1 μM）加入20 μL的100 nM激活劑-BO（A-BO，詳見支持信息中的C1.1節），然后加入2 μL兩端修飾有FAM和BHQ1的ssDNA（FQ-1，10 μM，見表S1）以及20 μL的Tris緩沖液。
使用A-BO-CRISPR檢測A549細胞中外源性和內源性H2O2
A549細胞被接種在96孔板中并培養至達到70-80%
A-BO-CRISPR的建立
我們首先在四種A-PS變體（A-PS至A-PS-4，見表S1；圖S1）上安裝了BOBr部分。在H2O2的觸發下，A-BO有效轉化為A-PS（圖S2A），從而可以隨后與RNP結合（圖S2B）。為了驗證上述概念，進行了傳統的PAGE分析（圖S3）。正如預期的那樣，所有含有PS的激活劑變體顯示出相似的電泳遷移率。與BOBr反應后，四條帶都顯示出了
結論
總結來說，我們開發了A-BO-CRISPR，這是一種可激活的CRISPR/Cas12a電路，通過特定的化學“關閉-開啟”開關實現腫瘤相關H2O2的實時成像。該系統具有快速（<90分鐘）、靈敏的檢測能力，并在復雜的生物環境中表現出穩健的性能。未來，這一策略可以擴展到監測其他氧化應激標志物或治療反應。未來的工作將集中在提高組織滲透性和探索
CRediT作者貢獻聲明
馮志遠：方法學、研究、數據分析。劉正：可視化、驗證、概念化。詹家銀：寫作 – 審稿與編輯、初稿撰寫、監督、研究、概念化。史陽：數據分析、數據管理、概念化。李志強：初稿撰寫、驗證、方法學、研究、數據分析。馮哲：可視化、軟件、資源。張文賢：可視化，
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的競爭性財務利益或個人關系。
數據可用性
數據將根據請求提供。
利益沖突聲明
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致謝
本研究得到了國家自然科學基金（批準號：22274072）、江蘇省自然科學基金（批準號：BK20242022）、中央高校基本科研業務費（批準號：2024300408）、生命科學分析化學國家重點實驗室（批準號：5431ZZXM2505）以及吉林省教育廳的科學技術研究項目（批準號：JJKH20261164KJ）的支持。
