合成生物學(xué)利用微生物細(xì)胞工廠將可再生底物轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)品，包括氨基酸、有機(jī)酸、維生素、功能性糖類、酶等，這已成為一門變革性學(xué)科，為能源可持續(xù)性、環(huán)境保護(hù)和醫(yī)療保健等緊迫問(wèn)題提供了創(chuàng)新解決方案。為了提高合成生物學(xué)中底盤菌株的生產(chǎn)能力，開(kāi)發(fā)先進(jìn)的基因組編輯和調(diào)控工具至關(guān)重要。目前的方法主要依賴于CRISPR/Cas系統(tǒng)，這些系統(tǒng)通過(guò)精確的靶向性和可編程性徹底改變了生物工程。在基因組編輯過(guò)程中，Cas核酸酶引起的DNA斷裂需要同源定向修復(fù)（HDR），這限制了同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)、大片段插入編輯的效率。這些技術(shù)障礙凸顯了開(kāi)發(fā)新的底盤菌株工程工具的迫切需求，這些工具能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因整合或精確的基因表達(dá)調(diào)控。

轉(zhuǎn)座子元件已被證明是基因組的動(dòng)態(tài)組成部分[1]，并且在所有主要系統(tǒng)發(fā)育分支中都檢測(cè)到了它們的存在[2]。這類移動(dòng)遺傳元件通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因組結(jié)構(gòu)重塑[4]、調(diào)節(jié)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[5]以及促進(jìn)遺傳變異的積累[3]，深刻影響了物種的適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)座子元件可以在沒(méi)有同源修復(fù)系統(tǒng)輔助的情況下插入片段，但缺乏在特定目標(biāo)位置插入的編程能力。近年來(lái)，通過(guò)結(jié)合CRISPR-Cas的可編程靶向性和轉(zhuǎn)座子的DNA插入能力，出現(xiàn)了CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶（CAST）。著名的例子包括源自霍亂弧菌的I型F CAST（Tn6677）和源自Scytonema hofmanni的V型K CAST[6][7][8]。這些CAST的發(fā)現(xiàn)為新型基因組編輯（尤其是基因插入）和表達(dá)調(diào)控工具的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。I型F CAST系統(tǒng)由Cascade（Cas6、Cas7、Cas8、crRNA）、TnsA、TnsB、TnsC和TniQ組成，采用“剪切和粘貼”機(jī)制進(jìn)行基因插入；V型K CAST系統(tǒng)由Cas12k、crRNA、TnsB、TnsC和TniQ組成，通過(guò)“復(fù)制和粘貼”轉(zhuǎn)座機(jī)制實(shí)現(xiàn)外源基因的基因組插入。V型K TnsC需要雙鏈DNA的變形來(lái)形成穩(wěn)定的螺旋纖維，這會(huì)導(dǎo)致脫靶插入；而I型F TnsC則無(wú)需DNA重塑即可組裝ATP依賴性的七聚體環(huán)，其脫靶插入相對(duì)較少[9][10][11]。目前，I型F CAST系統(tǒng)被廣泛采用。INsert Transposable Elements by Guide RNA-Assisted TargEting（INTEGRATE）系統(tǒng)及其衍生系統(tǒng)MUCICAT（利用CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行多拷貝染色體整合）為合成生物學(xué)中的基因插入提供了方便且可編程的工具[8][12]。INTEGRATE和MUCICAT已用于通過(guò)將目標(biāo)途徑表達(dá)盒插入基因組來(lái)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，從而降低了代謝壓力，有利于目標(biāo)生物合成[13][14]。

大腸桿菌因其遺傳背景明確、繁殖迅速和基因操作簡(jiǎn)單[15][16][17]，被廣泛用作合成生物學(xué)中的底盤菌株。減少大腸桿菌代謝底盤對(duì)質(zhì)粒的依賴已成為工業(yè)生物合成的優(yōu)先工程策略，通過(guò)消除質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性以及與抗生素抗性標(biāo)記和質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的代謝負(fù)擔(dān)，提高了遺傳穩(wěn)定性[18][19]。由于質(zhì)粒在基因操作中的便利性和高效性，它們常用于模塊化目標(biāo)途徑，不同模塊由不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒攜帶。為了實(shí)現(xiàn)從基于質(zhì)粒的模塊化優(yōu)化到穩(wěn)定基因組整合的穩(wěn)健過(guò)渡，我們旨在將這些大型多基因表達(dá)盒整合到多個(gè)基因組位點(diǎn)。我們還探索了利用CAST系統(tǒng)的靶向模塊進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，進(jìn)一步擴(kuò)展了其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用。

在這項(xiàng)研究中，基于INTEGRATE和MUCICAT系統(tǒng)，我們開(kāi)發(fā)了用于多基因位點(diǎn)插入大型多基因表達(dá)盒和多目標(biāo)抑制的工具，并進(jìn)一步優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用。首先，我們對(duì)CAST元件的啟動(dòng)子進(jìn)行了優(yōu)化以提高編輯效率。為了防止自我靶向，將crRNA與目標(biāo)基因共表達(dá)。通過(guò)將溫度敏感的復(fù)制子和levansucrase基因整合到轉(zhuǎn)座子傳遞質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)編輯起始和終止的進(jìn)一步控制，從而實(shí)現(xiàn)了快速清除質(zhì)粒。這種優(yōu)化的系統(tǒng)被稱為MUSCULAR-CAST（MUlti-Site CUt-burden, LARge-fragment genomic integration using CRISPR-ASsociated Transposases），能夠在多個(gè)基因組位點(diǎn)高效、低負(fù)擔(dān)地整合大型多基因表達(dá)盒。利用MUSCULAR-CAST，我們成功構(gòu)建了生產(chǎn)3-巖藻糖（3-FL）、L-色氨酸和角質(zhì)酶的底盤菌株。大小從1 kb到10 kb的多基因表達(dá)盒均成功整合到了基因組中，其中最復(fù)雜的包含七個(gè)酶基因。應(yīng)用MUSCULAR-CAST構(gòu)建的Thermobifida fusca（T. fusca）底盤菌株產(chǎn)生的3-FL和角質(zhì)酶突變體C_4Mz的產(chǎn)量或酶活性與質(zhì)粒表達(dá)的相當(dāng)或更高。此外，基于MUSCULAR-CAST的靶向模塊開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)錄抑制系統(tǒng)（Tn-CRISPRi），實(shí)現(xiàn)了低PAM依賴性的基因調(diào)控。通過(guò)調(diào)節(jié)crRNA和TniQ-Cascade（TniQ、Cas8、Cas6）的轉(zhuǎn)錄水平，Tn-CRISPRi幾乎以100%的效率同時(shí)抑制了這兩個(gè)位點(diǎn)，且對(duì)菌株生長(zhǎng)影響很小。在測(cè)試Tn-CRISPRi在合成生物學(xué)中的應(yīng)用時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制滲透調(diào)節(jié)的胞壁多糖生物合成蛋白H（mdoH）和運(yùn)動(dòng)蛋白A（motA）時(shí)，3-FL產(chǎn)量分別增加了2.79倍和4.40倍。總之，MUSCULAR-CAST基因整合工具和Tn-CRISPRi轉(zhuǎn)錄抑制工具的構(gòu)建和優(yōu)化及其應(yīng)用，為合成生物學(xué)中構(gòu)建和優(yōu)化高產(chǎn)底盤菌株提供了新的思路和方法。

合成生物學(xué)的核心在于底盤菌株的工程改造，主要是通過(guò)過(guò)表達(dá)目標(biāo)代謝途徑和敲除或抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑。目標(biāo)代謝途徑通常涉及多個(gè)基因，研究人員通常將這些基因分類為功能模塊并整合到具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中。這些質(zhì)粒上的基因通常位于多基因操縱子中。盡管質(zhì)粒使用方便且應(yīng)用廣泛

底盤菌株中的目標(biāo)代謝途徑通常涉及多個(gè)基因，這些基因的過(guò)表達(dá)通常會(huì)導(dǎo)致大型多基因模塊的形成。由于不同模塊通常需要不同的表達(dá)水平，因此通常使用多個(gè)質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行傳遞。基于質(zhì)粒的系統(tǒng)在底盤菌株工程中得到廣泛應(yīng)用，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨�因操作方面�?jiǎn)單且靈活。然而，過(guò)多的質(zhì)粒可能會(huì)帶來(lái)顯著的

Jing Wu：撰寫 – 審稿與編輯、項(xiàng)目管理、研究、資金獲取。Shengqi Gao：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、可視化、驗(yàn)證、軟件開(kāi)發(fā)、方法學(xué)研究、數(shù)據(jù)分析、概念化。luyao Wang：驗(yàn)證。Minglei Hou：驗(yàn)證。Mengwei Zhang：驗(yàn)證。Xuyang Zhu：驗(yàn)證。Hui Luo：驗(yàn)證。Xinrui Yu：驗(yàn)證。Huihui Lv：驗(yàn)證。Shumin Chen：驗(yàn)證。Yan Huang：資源提供。Kang

作者聲明他們沒(méi)有已知的可能會(huì)影響本文所述工作的競(jìng)爭(zhēng)性財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系。