《Frontiers in Immunology》：Genome-wide CRISPR/Cas9 screening identifies host factors critical for antiviral defense against equine herpesvirus type 1
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本研究通過全基因組CRISPR/Cas9篩選技術，系統鑒定出調控馬皰疹病毒1型（EHV-1）復制的關鍵宿主因子。研究發現，敲除PLEKHG5、ALOX15、SLC35A2等10個正向選擇基因可顯著抑制EHV-1的DNA復制（qPCR驗證）、病毒滴度（Reed-Muench法）及蛋白表達（Western blot），并延緩細胞病變效應（CPE）。京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體論（GO）富集分析顯示，這些基因富集于蛋白酶體、脂肪酸代謝等通路。該研究為開發宿主導向的抗EHV-1療法提供了新靶點。
1 引言
馬皰疹病毒1型（EHV-1）是α皰疹病毒亞科成員，為線性雙鏈DNA病毒，基因組約150 kb，編碼超過70個開放閱讀框。感染后可導致馬匹發熱、呼吸道癥狀，嚴重時引發流產或腦脊髓炎，死亡率達30%–50%。盡管現有疫苗和抗病毒藥物可部分控制疫情，但EHV-1仍頻繁暴發，其免疫逃逸機制（如gC糖蛋白屏蔽中和抗體表位、pUL56蛋白降解MHC-I分子）凸顯了病毒對宿主細胞的依賴性。近年來，CRISPR/Cas9技術為系統性解析病毒-宿主互作提供了高效工具，例如在HSV-1、流感病毒等研究中成功鑒定出PAPSS1、SLC35A1等關鍵宿主因子。本研究以易感EHV-1的BHK-21細胞為模型，通過全基因組CRISPR/Cas9篩選，旨在揭示調控EHV-1復制的宿主網絡。
2 材料與方法
2.1 質粒、細胞與病毒
使用Addgene來源的SPAX2、pMD2.G質粒及小鼠雙質粒CRISPR敲除庫，構建靶向PLEKHG5、ALOX15等基因的LentiCRISPRv2-Puro載體。BHK-21-Cas9穩轉細胞系由新疆農業大學獸醫學院保存，EHV-1 XJ2015毒株以MOI=0.5感染細胞，收獲病毒上清并測定滴度。
2.2 全基因組CRISPR篩選
將GeCKO庫慢病毒以MOI<0.3感染BHK-21-Cas9細胞，經嘌呤霉素篩選后，用致死劑量EHV-1攻擊7天，收集存活細胞。通過兩輪PCR擴增sgRNA區域，Illumina HiSeq測序分析sgRNA富集/耗竭情況，MAGeCK軟件鑒定正負選擇基因。
2.3 功能驗證
構建10個基因的敲除細胞系，CCK-8法檢測細胞活性，qPCR定量病毒DNA拷貝數，Western blot分析病毒蛋白表達，鏡檢觀察CPE動態變化。
3 結果
3.1 篩選質量評估
BHK-21-Cas9細胞中Cas9蛋白表達顯著（P< 0.001），慢病毒轉導效率>80%。測序數據清潔讀長占比超82%，錯誤率僅0.02%，病毒攻擊組sgRNA覆蓋率降至55.74%（對照組95.21%），表明篩選壓力顯著。
3.2 關鍵宿主因子鑒定
共識別5767個負選擇基因（如FOXD4、CDK20）和620個正選擇基因（如PLEKHG5、ALOX15）。前10個正選擇基因的sgRNA富集倍數均>2（P< 0.05）。
3.3 通路與功能富集
KEGG分析顯示候選基因富集于蛋白酶體、TCA循環、膽汁酸合成等代謝通路；GO分析提示其參與突觸囊泡循環、線粒體細胞色素c釋放等生物過程。
3.4 基因敲除抑制病毒復制
敲除PLEKHG5等基因后，EHV-1 DNA復制量在感染12小時顯著降低（qPCR，P< 0.001），病毒滴度下降超100倍，病毒蛋白表達量減少50%–80%（Western blot）。細胞活性未受影響，排除毒性干擾。
3.5 CPE緩解
Scramble對照組感染48小時出現嚴重CPE（細胞圓縮、脫落），而敲除組細胞形態保持完整，CPE明顯延遲。
4 討論
本研究首次通過全基因組CRISPR/Cas9篩選系統揭示EHV-1依賴的宿主因子網絡。已驗證的10個基因中，SLC35A2參與糖基化修飾，PSMC2調控蛋白酶體功能，PLEKHG5關聯細胞骨架運輸，均與皰疹病毒復制機制密切關聯。篩選數據亦提示EHV-1劫持宿主能量代謝（如TCA循環）及蛋白降解系統以支持自身復制。盡管存在跨物種（鼠源庫用于倉鼠細胞）及未開展回補實驗等局限，但結果為宿主靶向抗EHV-1策略提供了堅實理論基礎。后續需在馬源細胞或活體模型中驗證這些靶點的生理相關性，并評估其治療窗口安全性。
