在家禽生物技術(shù)領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)一直是個(gè)棘手難題。傳統(tǒng)方法如病毒載體和piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，雖然被廣泛應(yīng)用，卻難以逃脫表觀遺傳沉默的魔咒——轉(zhuǎn)基因表達(dá)往往出現(xiàn)組織特異性、隨時(shí)間遞減甚至完全沉默的現(xiàn)象。這種不穩(wěn)定性嚴(yán)重制約了需要跨組織長期穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。在哺乳動物中，科學(xué)家們通過將轉(zhuǎn)基因靶向整合到基因組合適港口位點(diǎn)（如Rosa26），成功實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定可預(yù)測的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，類似的策略在禽類系統(tǒng)中尚未建立。

密蘇里大學(xué)動物科學(xué)系的研究團(tuán)隊(duì)獨(dú)辟蹊徑，將目光投向了細(xì)胞內(nèi)始終活躍的"管家"——持家基因。他們假設(shè)，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向插入雞的持家基因ACTB和GAPDH中，可能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且泛表達(dá)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而解決禽類轉(zhuǎn)基因表達(dá)不穩(wěn)定的痛點(diǎn)。這項(xiàng)發(fā)表在《Poultry Science》上的研究，為家禽基因組工程帶來了突破性進(jìn)展。

研究人員主要采用了兩種關(guān)鍵技術(shù)方案：一是通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制，將包含Cas9和綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)框靶向插入到持家基因的3'區(qū)域；二是設(shè)計(jì)基因標(biāo)記策略，將Cas9-2A-GFP框插入到持家基因的最后一個(gè)內(nèi)含子中，使其表達(dá)受內(nèi)源基因調(diào)控元件的控制。實(shí)驗(yàn)在雞DF-1成纖維細(xì)胞系中進(jìn)行，通過熒光顯微鏡觀察、連接處PCR、Sanger測序等技術(shù)驗(yàn)證靶向整合效率，并利用T7E1 assay和流式細(xì)胞術(shù)評估Cas9的編輯活性和表達(dá)穩(wěn)定性。

研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)了特異性引導(dǎo)RNA（gRNA）靶向ACTB和GAPDH基因的3'區(qū)域和最后一個(gè)內(nèi)含子。T7E1 assay和測序分析顯示，針對ACTB基因的gRNA編輯效率分別為14.3%（3'區(qū)域靶向）和100%（內(nèi)含子靶向），而針對GAPDH的gRNA編輯效率分別為50%（3'區(qū)域靶向）和28.6%（內(nèi)含子靶向）。這些結(jié)果表明設(shè)計(jì)的gRNA具有高效的基因組編輯能力。

研究人員構(gòu)建了兩種類型的靶向敲入載體：針對3'區(qū)域靶向的策略使用CAG啟動子驅(qū)動Cas9和GFP表達(dá)；而基因標(biāo)記策略則巧妙地去除了外源啟動子，讓Cas9-GFP的表達(dá)完全依賴于內(nèi)源持家基因的調(diào)控機(jī)制。這種設(shè)計(jì)使得研究人員能夠比較外源啟動子驅(qū)動與內(nèi)源基因背景介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效果。

通過共轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9質(zhì)粒和供體質(zhì)粒，研究人員成功在DF-1細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了靶向整合。熒光顯微鏡觀察顯示，靶向編輯的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，而野生型細(xì)胞則無熒光信號。連接處PCR和測序分析進(jìn)一步證實(shí)了Cas9-GFP框精確整合到了預(yù)期的基因組區(qū)域，且整合位點(diǎn)存在NHEJ修復(fù)特有的小片段插入或缺失（indel）。

為評估整合Cas9的功能活性，研究人員用靶向DMRT1/DMRT3基因間區(qū)的gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染四種敲入細(xì)胞系。結(jié)果顯示，GAPDH靶向的細(xì)胞系（無論是3'區(qū)域敲入還是基因標(biāo)記）均表現(xiàn)出顯著的Cas9活性，而ACTB靶向的細(xì)胞系在相同條件下未檢測到編輯活性。測序分析進(jìn)一步證實(shí)，GAPDH靶向細(xì)胞系的編輯效率高達(dá)80-100%。

研究人員從GAPDH基因標(biāo)記的DF-1細(xì)胞系中分離出12個(gè)單克隆細(xì)胞系。通過連接處PCR和測序驗(yàn)證，所有克隆均成功實(shí)現(xiàn)了靶向整合，且均為雜合子（一個(gè)等位基因被精確修飾，另一個(gè)等位基因通過NHEJ修復(fù)產(chǎn)生indel）。定量PCR顯示各克隆的Cas9拷貝數(shù)相當(dāng)，但GFP表達(dá)水平存在明顯差異。

對隨機(jī)選擇的三個(gè)單克�。�#3、#13、#16）進(jìn)行長期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，GFP熒光在傳代至第12代時(shí)仍保持穩(wěn)定。Western blot分析證實(shí)了Cas9蛋白的表達(dá)，且表達(dá)水平與GFP熒光強(qiáng)度相關(guān)。重要的是，內(nèi)源GAPDH蛋白表達(dá)在所有克隆中均接近正常水平，表明靶向整合未顯著破壞內(nèi)源基因功能。功能實(shí)驗(yàn)顯示，這些單克隆細(xì)胞系的基因組編輯效率（77.8%-90%）顯著高于野生型DF-1細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)Cas9的效率（33.3%）。

研究結(jié)論與討論部分指出，該研究成功建立了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶向敲入策略，將功能性Cas9基因穩(wěn)定整合到雞GAPDH基因座，實(shí)現(xiàn)了高效、可持續(xù)的基因組編輯。相比之下，ACTB基因座雖然能夠支持報(bào)告基因表達(dá)，但可能由于表達(dá)水平不足或其他未知機(jī)制，未能產(chǎn)生可檢測的基因組編輯活性。

單克隆細(xì)胞系之間觀察到的表達(dá)和編輯效率差異，提示即使在同一整合位點(diǎn)，局部染色質(zhì)環(huán)境或表觀遺傳調(diào)控也可能顯著影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和功能。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在建立基因組編輯工具細(xì)胞系時(shí)進(jìn)行充分分子和功能驗(yàn)證的重要性。

該研究構(gòu)建的GAPDH靶向Cas9敲入DF-1細(xì)胞系為禽類系統(tǒng)提供了穩(wěn)定、可重復(fù)使用的基因組編輯平臺，避免了重復(fù)導(dǎo)入Cas9的需要，簡化了gRNA篩選、高通量誘變和功能基因組學(xué)研究的工作流程。此外，該策略還可擴(kuò)展至堿基編輯器或引物編輯器等其他基因組工程工具，以及組織特異性或誘導(dǎo)型表達(dá)框的整合。

盡管該研究主要在永生化成纖維細(xì)胞系中進(jìn)行，但研究人員在雞原始生殖細(xì)胞（PGC）中也驗(yàn)證了相同靶向策略支持穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力，表明該方法可能適用于多種雞細(xì)胞類型，并具有跨代基因組修飾的應(yīng)用潛力。最近的研究還確定了雞ROSA樣（cROSA）基因座（位于THUMPD3基因上游）作為禽類系統(tǒng)中的基因組安全港，與哺乳動物ROSA26基因座類似。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，雞基因組中存在多個(gè)允許性基因座可用于穩(wěn)定、功能性Cas9整合。

該研究的局限性包括所有實(shí)驗(yàn)均在單一永生化細(xì)胞系和體外條件下進(jìn)行，其向其他細(xì)胞類型或體內(nèi)應(yīng)用的普適性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，雖然GAPDH在本研究中表現(xiàn)出良好的敲入位點(diǎn)特性，但與其他持家基因或候選安全港位點(diǎn)的比較分析將有助于驗(yàn)證該策略的通用性。盡管存在這些限制，該研究為禽類系統(tǒng)中安全、可預(yù)測的轉(zhuǎn)基因整合建立了概念驗(yàn)證框架，為推進(jìn)家禽生物技術(shù)的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。