《Brain》：The HTT1a protein initiates HTT aggregation in a knock-in mouse model of Huntington’s disease
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本研究針對亨廷頓病中體細胞CAG重復擴展如何引發神經病理的問題，通過CRISPR-Cas9技術刪除Htt基因內含子1的隱性多聚腺苷酸化位點，構建HdhQ150ΔI小鼠模型。研究發現HTT1a蛋白是啟動HTT聚集的關鍵因子，降低HTT1a水平可延遲聚集數月并維持生物標志物NEFL/BRP39(YKL40)正常水平，為HTT降低治療策略提供新靶點。
亨廷頓病是一種遺傳性神經退行性疾病，其病因源于亨廷汀基因（HTT）外顯子1中的CAG重復序列異常擴展。這種突變導致亨廷汀蛋白（HTT）產生過長的多聚谷氨酰胺鏈，使得突變蛋白易于錯誤折疊和聚集。特別值得注意的是，突變CAG重復序列在特定神經元和腦區會隨年齡增長進一步擴展，這一現象被認為是疾病發病機制的第一步。近年來研究發現，當CAG重復序列擴展時，HTT前體mRNA內含子1中的隱性多聚腺苷酸化位點會被激活，產生提前終止的轉錄本HTT1a。該轉錄本編碼的HTT1a蛋白具有高度聚集傾向和強致病性。由于CAG重復序列越長，HTT1a產生量越多，一個重要科學問題隨之產生：HTT1a的產生是否就是體細胞CAG重復擴展發揮致病作用的機制？這一問題的解答對設計降低亨廷汀水平的治療策略至關重要。
為探究這一問題，研究團隊在亨廷頓病基因敲入小鼠模型中采用CRISPR-Cas9技術阻止HTT1a的產生。研究人員從HdhQ150小鼠的Htt內含子1中刪除所有潛在隱性多聚腺苷酸化位點，成功建立了兩種小鼠品系：一種在突變等位基因上攜帶內含子1缺失的雜合子（HdhQ150ΔI），另一種在野生型等位基因上攜帶缺失的雜合子（WTΔI）。兩個品系的CAG重復大小匹配良好，均約為195個CAG重復。
正如預測那樣，刪除Htt內含子1中的隱性多聚腺苷酸化位點確實阻止了HdhQ150ΔI小鼠中Htt1a轉錄本的生成。然而，研究人員仍檢測到極低水平的HTT1a蛋白，這是由Htt外顯子1和外顯子2的讀通產物所致，該產物保留了被刪除的內含子，并在內含子2的隱性多聚腺苷酸化位點終止。研究對HdhQ150、HdhQ150ΔI、野生型和WTΔI小鼠進行了長達17個月的觀察。
免疫組織化學和均相時間分辨熒光分析顯示，HdhQ150和HdhQ150ΔI大腦中的HTT聚集物均含有HTT1a，但HdhQ150ΔI大腦中可溶性HTT1a水平的顯著降低使聚集HTT1a的出現延遲了數月。盡管這種聚集病理的延遲僅部分逆轉了轉錄失調，但在17月齡的HdhQ150ΔI小鼠中，生物標志物NEFL和BRP39（YKL40）仍保持在野生型水平。
主要技術方法：
研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建HdhQ150ΔI小鼠模型，通過免疫組織化學和均相時間分辨熒光（HTRF）分析檢測HTT聚集，使用HdhQ150基因敲入小鼠模型（CAG重復約195次）進行長達17個月的縱向觀察，并評估NEFL/BRP39(YKL40)生物標志物水平。
研究結果：
HTT1a轉錄本生成被有效抑制
刪除隱性多聚腺苷酸化位點后，HdhQ150ΔI小鼠大腦中幾乎檢測不到Htt1a轉錄本，證實該策略可有效阻斷主要HTT1a產生途徑。
低水平HTT1a蛋白的意外發現
通過蛋白質檢測技術發現痕量HTT1a蛋白存在，經測序分析證實為Htt外顯子1-2讀通產物，該轉錄本保留了被刪除的內含子1序列，并利用內含子2中的隱性多聚腺苷酸化位點完成轉錄。
HTT聚集時間顯著延遲
盡管存在微量HTT1a，HdhQ150ΔI小鼠可溶性HTT1a水平大幅降低導致HTT聚集出現時間推遲數月，表明HTT1a是啟動聚集過程的關鍵因子。
轉錄失調部分改善
雖然聚集病理延遲僅部分緩解轉錄失調現象，但重要神經絲蛋白輕鏈（NEFL）和乳腺癌相關蛋白39（BRP39/YKL40）生物標志物在17月齡突變小鼠中仍維持野生型水平。
研究結論與意義：
本研究首次證實HTT1a蛋白是啟動亨廷頓病中HTT聚集過程的關鍵分子。盡管完全消除HTT1a面臨技術挑戰（如讀通轉錄本的存在），但顯著降低其水平已能有效延遲疾病病理進程。這一發現為亨廷頓病治療策略提供了重要方向：針對HTT1a的特異性干預可能比廣泛降低HTT水平更具治療價值且安全性更高。研究結果強調在未來亨廷汀降低治療策略中，需要特別關注HTT1a這一高度致病性亞型的特異性靶向，為開發更精準的亨廷頓病治療方法奠定了理論基礎。該研究發表于《Brain》雜志，為理解亨廷頓病發病機制和開發治療策略提供了重要科學依據。
