單細(xì)胞CHyMErA測(cè)序技術(shù)揭示外顯子缺失調(diào)控基因表達(dá)與細(xì)胞狀態(tài)動(dòng)態(tài)的新機(jī)制
《Nature Communications》：Single-cell exon deletion profiling reveals splicing events that shape gene expression and cell state dynamics
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本研究開發(fā)了scCHyMErA-Seq平臺(tái)，將CRISPR介導(dǎo)的外顯子刪除與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相結(jié)合，成功構(gòu)建了可同時(shí)捕獲Cas9/Cas12a向?qū)NA和polyA尾轉(zhuǎn)錄本的單細(xì)胞分辨率篩選體系。研究人員通過對(duì)224個(gè)選擇性外顯子進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)多個(gè)外顯子對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞周期進(jìn)程具有顯著調(diào)控作用，并以NRF1外顯子-7為例驗(yàn)證了其通過影響轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的新機(jī)制。該研究為在單細(xì)胞水平系統(tǒng)解析選擇性剪接的功能影響提供了重要技術(shù)平臺(tái)。
在真核生物中，選擇性剪接作為關(guān)鍵基因調(diào)控機(jī)制，能夠從一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，極大豐富了蛋白質(zhì)組的多樣性。這一過程幾乎影響所有蛋白質(zhì)編碼基因，不僅調(diào)控基因表達(dá)水平，更能通過生成不同蛋白異構(gòu)體來精確調(diào)節(jié)基因功能，從而響應(yīng)環(huán)境信號(hào)和細(xì)胞特異性需求。然而，大多數(shù)剪接變體的功能相關(guān)性仍不清楚，這成為RNA生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。尤其值得注意的是，選擇性剪接的失調(diào)與多種疾病和障礙相關(guān)，包括癌癥和自閉癥，凸顯了其在健康和疾病中的重要性。
傳統(tǒng)CRISPR基因敲除方法中，單引導(dǎo)靶向外顯子序列通常會(huì)產(chǎn)生移碼突變或框內(nèi)缺失，導(dǎo)致功能喪失或功能減弱的等位基因，這使得解釋外顯子特異性功能變得復(fù)雜。相比之下，CHyMErA（CRISPR混合多重編輯和篩選應(yīng)用）平臺(tái)能同時(shí)表達(dá)Cas9和Cas12a核酸酶以及雜交向?qū)NA（hgRNA），通過靶向側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域?qū)崿F(xiàn)精確的外顯子切除，同時(shí)保留周圍的編碼序列和閱讀框。這種策略允許直接評(píng)估單個(gè)外顯子對(duì)蛋白質(zhì)功能的貢獻(xiàn)。
盡管研究人員此前已經(jīng)優(yōu)化了CHyMErA系統(tǒng)，通過引入改良的Acidaminococcus sp（As）Cas12a變體顯著提高了大規(guī)模外顯子刪除篩選的效率，并發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)影響人類細(xì)胞適應(yīng)性的外顯子，但適應(yīng)性表型是定量的，它們對(duì)外顯子功能的機(jī)制洞察有限。更重要的是，改變適應(yīng)性的外顯子富含于基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因中，這凸顯了需要能夠系統(tǒng)地將外顯子擾動(dòng)與復(fù)雜分子表型（如轉(zhuǎn)錄程序）聯(lián)系起來的研究方法。
近年來，基因組編輯和單細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步使得能夠?qū)⒓线z傳擾動(dòng)與單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）結(jié)合。這些方法在捕獲多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄本的同時(shí)，通過條形碼策略或直接測(cè)序嵌入在多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄本中的gRNA來識(shí)別Cas9 gRNA。盡管這些方法很有用，但它們面臨局限性，包括條形碼與向?qū)NA解耦以及在部分CROP-Seq實(shí)施中g(shù)RNA檢測(cè)效率低的問題，盡管靶向擴(kuò)增sgRNA可以部分緩解后者。更近期的是，將捕獲序列納入tracrRNA的直接捕獲策略能夠?qū)崿F(xiàn)Cas9 gRNA與多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄本的同步檢測(cè)。然而，類似的用于Cas12a gRNA的直接捕獲解決方案尚屬缺乏，也沒有類似的用于外顯子中心擾動(dòng)篩選的框架。
為此，研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》上發(fā)表了題為“Single-cell exon deletion profiling reveals splicing events that shape gene expression and cell state dynamics”的研究論文，開發(fā)了單細(xì)胞CHyMErA測(cè)序（scCHyMErA-Seq）平臺(tái)，該平臺(tái)將高通量外顯子刪除與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高分辨率表型分析。通過修改Cas12a直接重復(fù)（DR）序列并實(shí)施定制的cDNA擴(kuò)增方案，該研究能夠在標(biāo)準(zhǔn)10x Genomics工作流程中實(shí)現(xiàn)Cas12a gRNA的穩(wěn)健捕獲，同時(shí)提高編輯效率。
研究人員主要采用了幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)方法：首先是改良的hgRNA支架設(shè)計(jì)，通過優(yōu)化Cas12a直接重復(fù)序列（DRv10）和引入tevopreQ1核糖開關(guān)，顯著提高了gRNA的穩(wěn)定性和捕獲效率；其次是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，使用10x Genomics平臺(tái)進(jìn)行液滴基單細(xì)胞捕獲和測(cè)序；第三是CRISPR-Cas9/Cas12a組合編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)精確的外顯子刪除；第四是功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包括流式細(xì)胞術(shù)、Northern blot、Western blot等；最后是生物信息學(xué)分析，包括差異表達(dá)分析、聚類分析和功能富集分析等。實(shí)驗(yàn)使用了HAP1細(xì)胞系（人單倍體細(xì)胞系）和HEK293細(xì)胞系。
研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用scCHyMErA-Seq篩選了224個(gè)選擇性外顯子，這些外顯子來自161個(gè)基因，此前已被鑒定為影響細(xì)胞適應(yīng)性。研究聚焦于能夠產(chǎn)生替代蛋白質(zhì)變體的保框外顯子，并優(yōu)先選擇了在涉及轉(zhuǎn)錄表型的基因中的外顯子。研究構(gòu)建了一個(gè)包含1066個(gè)hgRNA的慢病毒文庫(kù)，每個(gè)外顯子由三個(gè)獨(dú)立的向?qū)?duì)靶向，這些向?qū)as9和Cas12a導(dǎo)向側(cè)翼的內(nèi)含子區(qū)域。
scCHyMErA-Seq技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)化與驗(yàn)證
研究人員通過系統(tǒng)優(yōu)化hgRNA設(shè)計(jì)，解決了Cas12a gRNA在單細(xì)胞測(cè)序中捕獲效率低的問題。最初的設(shè)計(jì)在Cas12a gRNA的3'端附加 distinct 捕獲序列（CS2），但在測(cè)試中發(fā)現(xiàn)這種設(shè)計(jì)導(dǎo)致Cas12a gRNA的捕獲效率為0%。進(jìn)一步分析表明，CS的引入會(huì)明顯降低CHyMErA的編輯效率和Cas12a gRNA豐度。通過引入tevopreQ1核糖開關(guān)和優(yōu)化直接重復(fù)序列（DRv10），研究人員成功將Cas12a gRNA的檢測(cè)效率提升至61%，再通過定制化擴(kuò)增策略，最終實(shí)現(xiàn)約90%的捕獲效率。
外顯子刪除對(duì)轉(zhuǎn)錄程序的調(diào)控作用
通過分析212,217個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞的數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)103個(gè)基因（64%）和101個(gè)外顯子（45%）的擾動(dòng)顯著改變了至少200個(gè)基因的表達(dá)。其中，TAF5外顯子-8的刪除影響了1908個(gè)差異表達(dá)基因，CREBBP外顯子-25影響了2184個(gè)基因，EXOSC5外顯子-4影響了844個(gè)基因，NRF1外顯子-7影響了386個(gè)基因。這些擾動(dòng)富集于代謝通路、應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)級(jí)聯(lián)等生物學(xué)過程。
外顯子特異性調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)
研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)外顯子具有獨(dú)特的調(diào)控功能。例如，LSM11外顯子-3的刪除導(dǎo)致復(fù)制依賴性組蛋白轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)增加，這與U7 snRNP功能受損一致。類似地，TAF5外顯子-8刪除也導(dǎo)致組蛋白轉(zhuǎn)錄本表達(dá)增加，表明其在組蛋白3'端加工中的共同作用。這些發(fā)現(xiàn)揭示了外顯子在精細(xì)調(diào)控特定生物學(xué)過程中的重要作用。
NRF1外顯子-7在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵作用
研究人員重點(diǎn)研究了NRF1外顯子-7的功能。該外顯子編碼66個(gè)氨基酸片段，部分重疊于NRF1的DNA結(jié)合域。通過ChIP-Seq分析發(fā)現(xiàn)，外顯子-7的缺失導(dǎo)致NRF1在靶基因啟動(dòng)子上的占據(jù)顯著減少。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，SRSF3是促進(jìn)內(nèi)源性外顯子-7包含的關(guān)鍵因子，證明了剪接調(diào)控在轉(zhuǎn)錄因子功能中的重要性。
外顯子刪除對(duì)細(xì)胞周期的影響
通過單細(xì)胞水平分析細(xì)胞周期分布，研究發(fā)現(xiàn)了69個(gè)外顯子和76個(gè)基因的擾動(dòng)顯著改變了細(xì)胞周期分布。這些外顯子富集于核糖體生物發(fā)生、蛋白質(zhì)合成和RNA降解等功能類別，揭示了外顯子在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要功能。
與正交方法的比較驗(yàn)證
研究團(tuán)隊(duì)通過多種正交方法驗(yàn)證了scCHyMErA-Seq結(jié)果的可靠性。與基因組規(guī)模的Perturb-seq數(shù)據(jù)集比較顯示，差異表達(dá)基因存在顯著重疊，且轉(zhuǎn)錄反應(yīng)具有強(qiáng)一致性。與外顯子救援和堿基編輯方法的比較也證實(shí)了scCHyMErA-Seq檢測(cè)外顯子特異性表型的能力。
研究結(jié)論表明，scCHyMErA-Seq成功建立了一個(gè)多功能平臺(tái)，能夠系統(tǒng)解析外顯子水平擾動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)錄組的影響。該技術(shù)不僅揭示了外顯子在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的特異性功能，還為理解選擇性剪接在細(xì)胞命運(yùn)決定中的作用提供了新的視角。特別重要的是，研究發(fā)現(xiàn)外顯子水平的擾動(dòng)可以微調(diào)蛋白質(zhì)功能，產(chǎn)生與基因敲除僅部分重疊的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，且這些結(jié)果依賴于細(xì)胞狀態(tài)。
這項(xiàng)研究的重要意義在于：首先，技術(shù)上突破了單細(xì)胞水平外顯子功能篩選的技術(shù)瓶頸，為系統(tǒng)研究選擇性剪接的功能后果提供了強(qiáng)大工具；其次，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有重要調(diào)控功能的外顯子，為理解基因表達(dá)調(diào)控的精細(xì)機(jī)制提供了新見解；最后，研究揭示了外顯子特異性調(diào)控在細(xì)胞周期進(jìn)程等重要生物學(xué)過程中的作用，為疾病機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)提供了有價(jià)值的信息。該平臺(tái)的模塊化和可擴(kuò)展性使其成為組合遺傳擾動(dòng)研究的多功能工具，包括遺傳相互作用作圖和特定基因組元件的靶向 interrogation。
