《Cell Reports Methods》：Using DIPA-CRISPR for simple and efficient endogenous protein tagging in insects
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本研究針對蟑螂等卵鞘型昆蟲無法通過卵顯微注射實現大片段報告基因精準敲入的技術瓶頸，開發了基于DIPA-CRISPR與同源定向修復（HDR）的融合蛋白標記策略。通過在德國小蠊Blattella germanica的distal-less（dll）基因位點精準插入mCherry熒光蛋白，首次實現了活體胚胎中內源蛋白定位、豐度與動態的實時可視化，為半變態昆蟲的功能基因組學研究提供了關鍵技術支撐。
在昆蟲生物學研究領域，精準追蹤內源蛋白的時空動態是解析基因功能的關鍵。然而，對于蟑螂這類卵鞘型昆蟲，其卵塊（卵鞘）被堅硬外殼包裹，無法進行常規顯微注射，導致大片段熒光報告基因的敲入始終是技術難點。德國小蠊Blattella germanica作為半變態昆蟲的代表物種，其胚胎發育過程與人類疾病模型、害蟲防控研究密切相關，卻因技術限制長期缺乏高效的蛋白標記工具。
為突破這一瓶頸，研究人員將目光投向DIPA-CRISPR（直接親本CRISPR）技術。該技術通過向成年雌蟲腹部直接注射CRISPR組分，可繞過卵鞘屏障實現對生殖細胞基因編輯。然而，能否利用DIPA-CRISPR介導同源定向修復（HDR），實現熒光蛋白的精準敲入仍屬未知。本研究創新性地將DIPA-CRISPR與HDR模板結合，以distal-less（dll）基因——一個在肢體和神經系統發育中起核心作用的轉錄因子——為靶點，嘗試在活體蟑螂胚胎中實現mCherry熒光蛋白的內源標記。
關鍵技術方法包括：設計靶向dll基因終止密碼子附近的sgRNA；構建含長/短同源臂的mCherry供體模板（質粒與線性雙鏈DNA）；通過DIPA-CRISPR向成年雌蟲注射Cas9核糖核蛋白復合物與供體；利用熒光顯微鏡觀察胚胎蛋白定位，并通過PCR與測序驗證基因整合。實驗所用蟑螂樣本來自實驗室長期繁育的德國小蠊品系。
設計并驗證靶向dll基因的CRISPR組件
研究人員首先在dll基因編碼區末端設計了兩條sgRNA（sgRNA1與sgRNA2），其切割位點緊鄰終止密碼子，以確保蛋白功能不受破壞。體外消化實驗證實二者均能高效切割目標DNA片段。通過向雌蟲注射Cas9與sgRNA復合物，發現69個胚胎均發育正常，且T7內切酶檢測到靶位點突變，證明sgRNA在活體內具有編輯活性且無毒性。
基于DIPA-CRISPR的高效敲入策略
研究團隊構建了兩種HDR供體：含800 bp長同源臂的質粒供體，以及僅含30 bp短同源臂的線性雙鏈DNA供體。將Cas9、sgRNA與供體混合后注射至雌蟲體內，在13個卵鞘中有4個檢測到mCherry熒光信號，表明敲入成功。對照實驗（無Cas9組）無熒光產生，排除非特異性整合。通過PCR擴增mCherry序列及插入位點側翼區域，在G1代胚胎和若蟲中均驗證到精準整合，且測序顯示插入框位正確。
Dll::mCherry融合蛋白的胚胎空間分布
在4日齡活體胚胎中，Dll::mCherry蛋白呈現明顯組織特異性：熒光信號富集于附肢（如觸角、腿節）遠端尖端，與已知dll轉錄本分布一致；同時在中樞神經系統（如腹神經索）出現意外強信號，提示Dll在蟑螂神經發育中可能具有進化保守功能。這一發現首次實現無需抗體即可直觀觀察內源蛋白的動態分布。
研究結論與意義
本研究成功建立了一套適用于卵鞘型昆蟲的熒光標記技術體系，證實DIPA-CRISPR與HDR聯用可實現內源蛋白的可遺傳標記。盡管G0代胚胎為嵌合體且熒光檢測需犧牲樣本，但策略兼具可操作性（無需定制Cas9或特殊遞送系統）與靈活性（兼容質粒/線性供體）。該技術不僅為德國小蠊的發育生物學研究提供工具，更可推廣至其他難以顯微注射的昆蟲物種，在害蟲基因調控、生態進化研究等領域具有廣泛應用前景。論文成果發表于《Cell Reports Methods》，為非模式生物精準基因編輯提供了重要范式。
